Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1112199), страница 46
Текст из файла (страница 46)
Материал, предназначенный для исследования, следует иссекать острым инструментом очень бережно, превышая во всех направлениях необходимый размер на 1 — 2 мм. После затвердения материала в фиксаторе отсекают ненужные края острой бритвой. Не следует брать ту часть, которую сжимали пинцетом.
Если нет особой необходимости брать кусочки больших размеров, следует вырезать кусочки площадью 2 — 3 смз и толщиной не более 5 мм. Если материал необходимо отмыть от крови, используют изотонический раствор хлорида натрия (0,9%) или раствор Рингера (не воду!). Раствором Рингера нередко промывают сосуды исследуемого органа прежде, чем ввести в них фиксатор. Состав раствора Рингера: хлорида натрия 9,0 г, хлорида калия 0,42 г, хлорида кальция 0,25 г, дистиллированной воды до 1000 мл. Фиксация. Цель фиксации — убить клетку, прекратить происходящие в ней процессы (прежде всего ферментативные) и, по возможности, сохранить ее прижизненное строение.
Извлеченные из организма ткани очень скоро претерпевают сильные изменения. Они подвергаются аутолизису, самоперевариванию гидролитическими ферментами, находящимися в клетках. Необходимо остановить эти посмертные процессы, коагулировать белки и инактивировать ферменты. Для этого используется фиксация материала, а растворы, употребляемые с этой целью, называются ф и к с а т о р ам и. Существует ряд общих правил фиксации: 1) объем фиксирующей жидкости должен не менее чем в 20 раз превышать объем фиксируемого кусочка ткани; 2) фиксатор должен иметь доступ к фиксируемому материалу со всех сторон, поэтому на дно сосуда кладут вату или фильтровальную бумагу или кусочек подвешивают на нитке; 3) продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, прежде всего от скорости его проникновения в фиксируемые ткани.
Скорость диффузии фиксатора в ткани следует учитывать и при определении допустимых размеров кусочка фиксируемого органа: чем медленнее действует фиксатор, тем тоньше должен быть кусочек. Слишком длительное пребывание материала в фиксаторе ухудшает его качества. Для длительного хранения материала пригодны лишь некоторые фиксаторы, такие как 10'/о формалин или жидкость Буэна; 4) различные фиксаторы сохраняют различные структурные и химические компоненты клетки, поэтому при подборе фиксатора необходимо исходить из целей исследования и из планируемых методов дальнейшей обработки материала.
Другими словами, использованный фиксатор может влиять на качество окраски материала различными методами; 5) в фиксирующие жидкости, содержащие сулему или осмий, опускать металлические инструменты нельзя. Фиксацию обычно проводят при комнатной температуре, но при использовании таких медленно действующих 204 фиксаторов, как осмиевая кислота, особенно при планировании последующего гистохимического или электронно-микроскопического исследования, ее осуществляют при температуре +4'С.
Различают фиксирующие средства (простые фиксаторы) и фиксирующие смеси (сложные фиксаторы). Простые фиксаторы. 1. Ф о р м а л ь д е г и д (формалин). Быстро диффундирует. Материал в нем может сохраняться длительное время. Однако следует учесть, что длительная фиксация в формалине может вызвать отложение осадка, затрудняющего анализ препаратов. Формалин, поступающий в продажу, представляет собой 40'/» раствор формальдегида. Разведение формалина 1:10 представляет собой 4'/» раствор формальдегида. Время фиксации в формалине минимум 24 — 48 ч.
Под влиянием света в формалине образуется муравьиная кислота, которая его подкисляет. Для фиксации обычно используют нейтральный формалин. Для нейтрализации формалин помещают в темную банку, на дно которой насыпают порошкообразный мел или магнезию (100 г на 1 л формалина). Содержимое банки взбалтывают и оставляют на сутки, после чего реакция формалина обычно нейтральная. Иногда требуется более точное значение рН. Тогда используют 4'/» формалин, забуференный при помощи фосфатного буфера в концентрации 0,075 М, рН 7,6 с добавлением сахарозы до концентрации 0,44 М (некоторые сведения о буферных растворах см. ниже).
После фиксации в форма- лине ткани тщательно промывают водопроводной водой. 2. Этиловый спирт 96'/» или а 6 с оп ютн ы й (100'/»). Для приготовления абсолютного спирта 96'/» спирт наливают на прокаленный сульфат меди, лишенный кристаллизационной воды и имеющий вид серовато-белого порошка. Отнимая воду от спирта, он приобретает синий цвет. Обезвоживание лучше проводить последовательно в двух или трех сосудах. При этом в последнем сосуде медь остается почти безводной и абсолютный спирт над ней может храниться долго. Время фиксации в этиловом спирте — 12 — 24 ч, при этом фиксатор нужно 3 раза сменить. Преимущества метода: быстрота, пригодность почти для всех методов окрашивания, хорошая сохранность водорастворимых элементов (гликоген, мочевая кислота).
3. Метиловый спирт (метанол) является прекрасным фиксатором для высушенных на воздухе мазков крови и красного костного мозга. Стекла с мазками помещают на 5 — 10 мин в стаканчик с притертой пробкой, наполненный метанолом. Затем стекла извлекают пинцетом и ставят ребром на фильтровальную бумагу для просушивания. При работе с метиловым спиртом необходимо учитывать, что он является сильным ядом, и соблюдать правила использования и хранения ядовитых веществ. Сложные фиксаторы представляют собой фиксирующие смеси, состоящие из нескольких веществ.
1. Жидкость Мюллера: 2 — 2,5 г бихромата калия, 1 г сульфида натрия и 100 мл дистиллированной воды. Используется 205 преимущественно в качестве основы для других фиксаторов. В чистом виде может применяться для фиксации миелиновых волокон. 2. Жидкость Це н к е р а состоит из100млжидкостиМюллера с добавлением 5 г сулемы.
Непосредственно перед употреблением добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты. Время фиксации 12 — 24 ч. Промывают в проточной воде в течение 24 ч. 3. Це нке р-фор мол по Максимову. К жидкости Ценкера вместо уксусной кислоты добавляют 10 мл формалина. Время фиксации 1 — 6 ч. Промывают в проточной воде в течение 24 ч. 4.
Жид кость Б у э на: 15млнасыщенноговодногораствора пикриновой кислоты, 5 мл формалина, 1 мл ледяной уксусной кислоты. Продолжительность фиксации 2 — 24 ч. Промывают в 70 — 80% спирте, который 2 — 3 раза сменяют. Это один из лучших фиксаторов, пригодный как для обзорных препаратов, так и для тонких исследований. Ткани в фиксаторе сжимаются лишь на 2 — 3"/, поэтому он пригоден для эмбриональных препаратов. 5.
Жид кость Кар ну а: 60 мл абсолютного спирта, 30 мл хлороформа и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Время фиксации в зависимости от величины объекта от 10 мин до 2 — 3 ч. Промывают в абсолютном спирте. Промывка. Цель ее — удаление фиксатора или его осадков. Как уже было сказано, для промывки в зависимости от использованного фиксатора применяют водопроводную воду или спирты различной концентрации. Водопроводной водой материал промывают в течение 24 — 48 ч.
Для промывки можно использовать стеклянную банку, обвязанную марлей, через отверстие в которой до дна сосуда пропущен резиновый шланг. Вполне пригодна для промывки гистологического материала колба, в пробку которой вставлены стеклянная воронка и отводящая трубка. Воду из крана пускают в воронку, а отток воды происходит через отводящую трубку. При необходимости промывки одновременно нескольких кусочков материала можно приспособить к крану распределительную трубку, из которой вода по резиновым трубкам подается в несколько банок с образцами.
Мелкие объекты промывают в стеклянных трубках, обвязанных марлей, помещенных в открытую банку, куда поступает водопроводная вода. Уплотнение материала. Для того чтобы можно было получить тонкие срезы, необходимо уплотнение. Самым быстрым способом уплотнения является з а м о р а ж и в а н и е. Другой способ уплотнения — заливка в застывающие среды, такие как п а р а ф и н или ц е л л о и д и н. После воздействия водных фиксаторов и промывания материал пропитан водой. Ни парафин, нн целлоидин в воде не растворяются.
Поэтому следующим этапом обработки является удаление воды — о б е з в о ж и в а н и е. Обезвоживание осуществляется путем проводки материала по батарее этилового спирта возрастающей концентрации: 50 /о, 60~/о, 701/о, 801/о, 96 /о, абсолютный 1-й„ абсолютный 2-й. Чем нежнее и богаче водой материал, тем более 20в постепенно должна возрастать концентрация спирта, чтобы уберечь материал от сморщивания, Если промывание проводилось в спирте, то проводку начинают с 80 — 96% спирта.
Время пребывания в каждой баночке со спиртом варьирует в зависимости от величины и плотности кусочка материала от 1 — 2 ч до 1 — 2 сут. Заливка в парафин. После обезвоживания материал пропитан спиртом, но парафин в спирте также не растворяется, поэтому сначала материал должен быть помещен для удаления спирта в промежуточное вещество: ксилол, хлороформ, толуол или бензол.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
