Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1112199), страница 49

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 49)

Если материал крошится, то это может зависеть от слишком 214 большого наклона ножа или от слишком тугоплавкого парафина и низкой температуры окружающей среды. Правильный угол наклона можно найти эмпирически, попробовав разные углы наклона. Устранить влияние низкой температуры можно, подышав на блок или пристроив настольную лампу таким образом, чтобы она светила на блок и слегка его согревала. Если залитый материал отделяется от парафина или выпадает из него, причина может заключаться в недостаточном удалении из материала спирта или в использовании при заливке слегка охлажденного парафина. В любом случае материал нужно поместить обратно в промежуточную среду (ксилол, хлороформ) и затем повторить заливку.

Если срезы разрываются или покрываются бороздками, это означает, что на ноже есть зазубрины. Можно попробовать слегка подвинуть нож, так чтобы на блок приходился другой его участок. Если это не поможет, необходимо точить нож заново. Закручивание срезов и нх прилипание к ножу встречаются при очень мягком парафине и высокой температуре окружающей среды. В этом случае перед резкой можно положить блок в холодильник, а во время резки время от времени класть на него кусочек льда, завернутый в марлю. Причиной того, что не каждый срез, а лишь каждый второй годен для исследования, может быть неправильный угол наклона ножа.

Возможно также, что срезы слишком тонки для данного метода или качества заливки. В этом случае нужно на несколько микрометров увеличить толщину среза. Если блок плохо режется, нож подскакивает на поверхности блока и толщина срезов неровная, это объясняется чрезмерным уплотнением материала при фиксации. Исправить этот недостаток нельзя, но можно попробовать подышать на блок и поставить микротомный нож не перпендикулярно, а под углом. Серии срезов при этом получить нельзя, но отдельные срезы режутся лучше. В сухую погоду срезы электризуются и сильно прилипают к ножу. Это можно предотвратить, подьш~ав на нож перед резанием. Марки ро в к а стекол обычно следует за резанием блоков. Для этого при наклеивании срезов на блок одни конец стекла оставляют свободным.

Надпись на стекло можно наносить с помощью алмазного отметчика, но чаще это делается тушью. Так как тушь размазывается или стирается, следует ее наносить на смазанный белком и высушенный конец стекла. Затем этот конец нагревают над спиртовкой. Надпись при этом фиксируется и в дальнейшем не стирается. Окрашивание и заключение срезов Окрашивание срезов обычно требует предварительной подго- товки. Для парафиновых срезов такой подготовкой является удале- ние парафина — д е и а р а ф и н и р о в а н и е. Батарея для депара- 215 финирования включает высокие бюксы или биологические стаканчики, содержащие две порции ксилола — ксилол 1, ксилол П, абсолютный спирт„96'/ спирт, 70'/о спирт и стаканчик для воды.

Если в дальнейшем используется спиртовой краситель, то срезы в него переносятся прямо из спирта, минуя воду. Если материал был фиксирован сулемовым фиксатором (жидкость Ценкера), то в батарею нужно включить для удаления сулемы бюксы с йодистым спиртом и тиосульфатом натрия. Иодистый спирт готовят, добавляя к 70% спирту несколько миллилитров раствора йод-йодида калия. Для приготовления основного раствора йод-йодида калия в 10 мл дистиллированной воды растворяют 3 г йодида калия (К1), в 90 мл абсолютного спирта растворяют 2 г йода и затем смешивают оба раствора. Тиосульфат натрия готовят в виде 0,25'/о раствора. Предметные стекла складывают попарно так, чтобы срезы были обращены к поверхности, и помещают в стаканчик или бюкс под углом друг к другу. Для одновременной обработки большего количества срезов используются стеклянные кюветы, в которых можно разместить сразу 10 — 20 стекол.

При депарафинировании срезы держат в ксилоле 1 и П, а также в спиртах по 2 — 3 мин, в йодистом спирте и тиосульфате натрия 10 мин. Далее следует промывка в дистиллированной воде (после тиосульфата натрия — в нескольких порциях воды). Целлоидин из целлоидиновых срезов перед окрашиванием, как правило, не удаляется, но в случае необходимости он легко может быть растворен ацетоном, спиртом с эфиром или гвоздичным маслом. При этом целлоидиновые срезы наклеивают на предметное стекло, покрытое белком с глицерином, плотно прижимают смоченной в 70% спирте фильтровальной бумагой и заливают гвоздичным маслом.

Затем дают маслу стечь и переносят срезы в ацетон, спирт с эфиром или абсолютный спирт, после чего их помещают в 70'/~ спирт и дистиллированную воду. Красители и их приготовление. Красители различают основные, кислые и нейтральные. Основной к р а с и тел ь представляет собой красящее основание или его соль, кислый красит е л ь — красящую кислоту или ее соль. При соединении водных растворов кислого и основного красителей может образоваться соединение красящей кислоты с красящим основанием — н е й тральный краситель. Структуры, красящиеся основными красителями, имеют кислую реакцию (например, содержат ДНК или РНК) и называют б а з оф и л ь н ы и и, т.

е. любящими основные краски. К базофильным структурам в клетке относится ядро. Структуры, красящиеся кислыми красителями, называются а ц и д о ф и л ь н ы м и. Цито- плазма клеток чаще всего бывает ацидофильной. Если срезы оставляют в красителе только до тех пор, когда они будут достаточно окрашены, то такой метод окрашивания называется прогрессивным. Регрессивным методом о к рашн в а н ия называется такой метод, когда срез сначала г~е окрашивается чересчур интенсивно, а затем избыток краски удаляется путем отмывания (дифференцировки). Общие правила окрашивания: 1) перед применением красители следует профильтровать; 2) при окрашивании в течение длительного времени красителями низкой концентрации достигаются лучшие результаты, чем при окраске в течение короткого времени красителями высокой концентрации; 3) более четкая окраска обычно достигается использованием регрессивных методов, когда фон убирается дифференцировкой; 4) после дифференцировки необходимо тщательно отмыть срез, иначе осгаток дифференцирующего вещества его быстро обесцветнт.

Просветление и заключение срезов. Окрашенный препарат сначала обезвоживают„проводя по спиртам возрасгающей концентрации до абсолютного, затем помещают в ксилол или бензол, в результате чего срезы и ро с в е тл я ются,т. е. становятсяоднородными в отношении преломления света — прозрачными. Обезвоживания в абсолютном спирте иногда недостаточно, так как абсолюгньш спирт притягивает влагу из воздуха. Если срезы недостаточно обезвожены, то после помещения в ксилол они остаются мутными„и это в дальнейшем помешает их микроскопированию. В этом случае после обезвоживания в 96зй спирте срез помещают в карбол-ксилол, в котором он полносп,ю обезвоживается и частично просветляется, затем переносят в ксилол. Для приготовления карбол-ксилола кристаллический фенол расплавляют в термостате при температуре 56'С и смешивают с ксилолом в отношении 1:4.

Карбол-ксилол разрушает некоторые красители, поэтому срезы в нем следует держать не более 2 — 3 мин, а затем тщательно промывать ксилолом. Если препарат окрашен на жир, то его нельзя проводить через спирты и просветлять в ксилоле, так как эти вещества являются растворителями жира. В этом случае срезы просветляют в глицерине или растворе ацетата калия и заключают в эти же среды или в глицерин-желатин (см. ниже). Для обезвоживания и просветления срезов, наклеенных на стекло, используют батарею высоких бюксов или биологических стаканчиков, заполненных 70%, 96'l~ и абсолютным спиртами, а также ксилолом. Целлоидиновые срезы обыкновенно обезвоживают и просветляют ненаклеенными, проводя их с помощью препаровальной иглы или стеклянной палочки с загнутым под прямым углом концом через батарею низких бюксов, заполненных теми же растворами.

Для обезвоживания целлоидиновых срезов лучше пользоваться карбол-ксилолом, так как под влиянием абсолютного спирта они становятся слишком мягкими. Заключение гистологических срезов производят с целью получения из них пригодных для микроскопирования н хранения препаратов. Для этой цели чаще всего используют ка наде к и й бал ьз а м, разведенный в ксилоле. Кусочки канадского бальзама заливают ксилолом и сгавят в термостат. Кснлол добавляют в таком ггг количестве, чтобы бальзам получился жидким и его можно было профильтровать.

Затем бальзам оставляют в открытой склянке в вытяжном шкафу до тех пор, пока ксилол испарится настолько, что бальзам приобретает консистенцию жидкого меда. Если бальзам хранят в специальной баночке с притертым колпачком, края колпачка смазывают вазелиновым маслом„чтобы он не присох к баночке. Канадский бальзам имеет кислую реакцию, что вредно отражается на препаратах, окрашенньзх некоторыми красителями. Для нейтрализации куски канадского бальзама разжижают путем нагревания и добавляют к нему немного порошка карбоната калия.

Характеристики

Список файлов книги