Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1112199), страница 48
Текст из файла (страница 48)
В холодильник вмонтированы микротом (криотом),имеется освещение. В передней стенке криостата имеется окошечко, в боковых стенках — отверстия с рукавами для рук оператора. Микротом в криостате обычно ротационный, ткани примораживаются к латунным держателям„держатель фиксируется на специальном стержне. Микротомный нож закреплен неподвижно, а объект при резке подводится к ножу. Существуют различные методы дальнейшей обработки срезов: 1) срез снимают на теплое (с температурой, равной комнатной) илн холодное (с температурой, равной температуре крностата) покровное илн предметное стекло и фиксируют в момент таяния; 2) срез снимают на теплое или холодное покровное илн предметное стекло, дают ему оттаять н подсушивают на воздухе, после чего он может быть фиксирован или не фиксирован в зависимости от дальнейшего исследования; 3) срез переносят в теплый или холодный раствор реактива (инкубационной среды при гнстохимическом исследовании ферментов); 4) срез переносят в банку с теплым или холодным фиксатором„5) срез подвергают лиофильной сушке.
Микро томные ножи бывают прямые (когда обе стороны ножа плоские) и плосковогнутые (одна сторона плоская„другая — вогнутая). Первые применяются для получения парафиновых, вторые — для получения целлоидиновых срезов. Кроме того, существуют двояковогнутые микротомные ножи. В месте пересечения плоскостей широких поверхностей микротомного ножа образуется угол, называемый у г л о м л е з в и я(см. рис. 79). Микротомные ножи затачиваются под углом, большим, чем угол лезвия, н этот угол заточки называется режущим углом. Плоскости заточек микротомного ножа, образующие режущий угол, получили название фасеток. Ширина фасеток должна быть 1,5 — 2 мм.
Точка ми кр от о ми ы х ноже й имеет важное значение в работе лаборанта-гистолога, так как именно от состояния ножа зависит качество среза. Ножи подвергают электролитической точке либо точат на точильных камнях. Электролитическая т о ч к а основана на растворении металла в электролите под действием электрического тока. При этом режущий край истончается и образуется фасетка. Точка на точильных камнях производится на брусках бельгийского камня с мелким зерном и затем на белом камне — арканзасе с еще более мелким зерном. На стержень ножа надевают ручку, а на спинку прямого ножа — обушок (рис.
80, А, Б). Плосковогнутые ножи точат с направителем, наложенным на плоскую поверхность, а двояковогнутые ножи — без обушка и без направителя. У каждого ножа должен быть свой постоянный обушок или направитель. Точку производят на смазочном вазелиновом масле или воде. Чем плотнее среда, на которой точится нож, тем точка идет медленнее, но фасетка получается ровнее. Можно начи- 211 Рнс.
БО. Заточка ьзикротомных ножей. А — инструмент двл заточки микротомимх ножей; а — ручка; б — обушок дл» точки микротомного ножа (ло В. Г. Елисееву и др., 19бу); Б — аорлдок вождении микротомиого ножа оо точильному иамию (ио Д. Кисели, 1962). пать точку на воде, а заканчивать — на масле. Точат нож на камне, начиная от ручки, всегда продвигая лезвием вперед. Лезвие ножа ведут от одного края бруска до другого так, чтобы через этот последний край нож прошел своим концом, затем перевертывают нож через обушок и таким же образом проводят другой стороной ножа по бруску (см. рнс.
80, Б). Нож должен идти свободно. Давить на него не следует. Качество заточки ножа контролируют под микроскопом. После белыийского камня точат на белом камне— 2!2 арканзасе. Время точки ножа зависит от его состояния и твердости стали. Если на ноже есть глубокие зазубрины, точка может занимать несколько часов, при хорошем состоянии ножа — 20 — 30 мин. После точки на камне нож правят на ремне. При этом пользуются широким ремнем с войлочной прокладкой, натянутой на деревянную колодку. Нож при правке ведется обушком вперед и переворачивается также через обушок, чтобы не испортить режущий край.
Приготовление парафиновых и целлоидинпвых срезов. Блок фиксируют в объектодержателе так, чтобы длинная ось блока располагалась вдоль длинной оси микротома, а поверхность блока горизонтальной. Очень важна правильная установка ножа. Оптимальным углом наклона ножа считается такой, когда плоскость фасетки совпадает с плоскостью среза. На практике угол наклона ножа обычно несколько больше оптимального. Если угол наклона ножа слишком велик, материал будет крошиться, если слишком мал, нож будет 1 — 2 раза проскальзывать над блоком, а потом срезать толстый срез.
Парафиновые блоки режут прямым ножом, целлоидиновые— плосковогнутым. При резке парафнновых блоков нож устанавливают перпендикулярно оси микротома или слегка под углом. В последнем случае нельзя получить серийных срезов, но зато очень плотные и трудно режущиеся объекты режутся легче. При резке целлоидиновых срезов нож устанавливают под углом. Когда нож установлен, к нему осторожно подводят блокодержатель с блоком и одновременно придвигают нож к блоку. Подачу объектодержателя осуществляют с помощью кремальеры, расположенной в основании объектодержателя, либо рукой, толкая санки объектодержателя вдоль наклонных рельсов.
Когда блок и нож сближены, проверяют горизонтальность верхней поверхности блока, которая не должна доходить до лезвия ножа на 0,5 — 1 мм. После этого устанавливают микрометрическую шкалу на получение толстых срезов (30 мкм) и движением салазок ножа начинают подавать блок вверх до тех пор, пока не начинают получаться первые полные срезы, затем микрометрическую шкалу следует установить на необходимую толщину срезов. Парафиновые срезы делают толщиной 7 — 10 мкм. При очень хорошо залитом материале и хорошо наточенном ноже можно получить срезы толщиной 3 — 5 мкм. Толщина целлондиновых срезов обычно составляет 12 — 15 мкм. Парафиновые срезы режут сухим ножом.
Прн резке целлоидиновых срезов поверхность ножа и поверхность блока постоянно смачивают 70% спиртом. Полученные парафиновые срезы осторожно, не прикасаясь к режущему краю ножа, снимают влажной кисточкой или препаровальной иглой н помещают в чашку с теплой водой илн сразу наклеивают на предметное стекло (см. ниже). Если блоки небольшие и прямоугольные, при поперечном положении ножа при резке из срезов получают ленточки (серии). Отдельные срезы не снимают с ножа. Края их прикреплены друг к другу, и они располагаются полоской друг за другом.
Эту полоску снимают целиком для шз дальнейшей обработки. Парафиновые срезы всегда слегка сморщены и имеют складки. Эти морщинки и складки необходимо расправить, либо поместив срезы на поверхность теплой (не горячей, чтобы не расплавился парафин!) дистиллированной воды, либо в процессе наклеивания на предметное стекло. Наклеивают парафиновые срезы на чистые обезжиренные предметные стекла, смазанные белком с глицерином.
Для приготовления последнего свежий яичный белок взбивают шпателем и фильтруют через смоченный дистиллированной водой бумажный фильтр. К профильтрованному белку добавляют равный объем глицерина, смешивают и кладут для предупреждения загнивания 2 — 3 кусочка тнмола величиной с зернышко пшеницы. В закрытой склянке белок с глицерином хранится длительное время.
Маленькую капельку белка с глицерином наносят на предметное стекло и пальцем размазывают тонким слоем по стеклу. Если срезы были помещены в чашку с дистиллированной водой, белок на стекле коагулируют, подержав стекло над спиртовкой белком вверх. Затем расправленный срез при помощи кисточки вылавливают из воды и переносят на стекло. Осторожно наклоняя предметное стекло, дают воде стечь и затем на 12 — 24 ч стекло переносят в термостат с температурой 37'С. Более употребителен другой способ наклеивания и расправления парафиновых срезов. При этом на смазанное белком с глицерином предметное стекло наносят несколько капель дистиллированной воды, на которую прямо с микротомного ножа переносят срезы. Затем стекло осторожно подогревают над спиртовкой до полного расправления срезов, при этом следует избегать расплавления парафина, так как в противном случае материал портится.
Излишнюю воду осторожно удаляют фильтровальной бумагой, и стекла оставляют для просушки при комнатной температуре или в термостате при 37'С. Вместо спиртовки для расправления парафиновых срезов можно использовать специальный электрический прибор «Приспособление для сушки и расправления парафиновых срезов», представляющий собой подогреваемый до нужной температуры столик. На покрытое белком стекло наносят несколько капель дистиллированной воды, кладут стекла на столик и переносят на него срез.
После расправления среза лишнюю воду удаляют фильтровальной бумагой и оставляют стекло с наклеенным срезом на столике для досушивания. Целлондиновые срезы переносят с ножа в низкий бюкс с 70'/» спиртом и в дальнейшем окрашивают без наклеивания на предметное стекло, помещая срезы с помощью препаровальной иглы с загнутым концом или стеклянным крючком в соответсгвующие реактивы. Правила резки парафиновых блоков и некоторые способы устранения возможных недостатков заключаются в следующем. Передвигать салазки ножа нужно равномерно, не нажимая на них.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
