Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1112199), страница 53
Текст из файла (страница 53)
Лилле, 1969) з рн 1 М раствор 0,1 М раствор Глава 22 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Последовательность работы та же, что и при приготовлении гистологических препаратов для исследования с помощью световой микроскопии: взятие материала, фиксация, промывка, обезвоживание, уплотнение, получение срезов, окрашивание. Однако в каждом из этих процессов имеются особенности.. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА И ФИКСАЦИЙ При взятии материала необходимо учитывать, что его объем не должен превышать 1 ммз. Чтобы избежать посмертных изменений тканей, можно дать животному наркоз, взять материал еще у 230 30 29 28 27 26 25 24 23 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 б 5 4 3 2 20 21 22 23 24 25 26 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 0,69 0,75 0,81 0,90 0,98 1,05 1,12 1,23 1,35 1,43 1,52 1,61 1,70 1,76 1,82 1,92 2,02 2,11 2,20 2,29 2,38 2,45 2,52 2,62 2;П 2,85 3,00 3,17 3,32 1,53 1,56 1,63 1,66 1,71 1,77 1,80 1,84 1,89 1,94 2,00 2,05 2,10 2,15 2,23 2,27 2,31 2,38 2,44 2,50 2,56 2,63 2,70 2,79 3,02 3,14 3,23 3,44 живого животного и затем умертвить его, превысив дозу наркоза.
В некоторых случаях материал фиксируют перфузией фиксатором органа животного, находящегося под наркозом (например, при взятии мозга). В настоящее время все чаще используют двойную фиксацию: фиксацию в 2 — 4'/» растворе глутаральдегида (1,5 — 4 ч) и постфиксацию в растворах, содержащих четырехокись осмия (1— 2 ч).При этом глутаральдегид лучше фиксирует белки, а осмиевые фиксаторы — липиды.
Для поддержания нужного значения рН фиксаторы разводят на буферных смесях„а для создания определенного осмотического давления добавляют определенные количества саха- розы. Осмиевые фиксаторы нельзя использовать, если планируется электронно-гистохимическое исследование ферментов.
В этом случае лучше использовать формальдегид, который фиксирует значительно хуже, но действует более мягко, не разрушая ферменты. Осмиевые фиксаторы. Готовить осмиевые фиксаторы необходимо не позже чем за сутки до употребления, так как четырехокись осмия (ОзО4) растворяется очень медленно. Четырехокись осмия восстанавливается на свету, поэтому ее навески (около 1 г) хранят в специальных запаянных пробирочках, завернутых в черную бумагу, а растворы — в банках из темного стекла. Посуда должна быть химически чистой. Свежепрнготовленный раствор можно оставить в темном месте при комнатной температуре на ночь, а затем поставить в холодильник. Если осмиевый фиксатор приобретает коричневую окраску, значит он пришел в негодность. Из осмиевых фиксаторов одним из лучших является фиксатор Миллонига.
Он лучше сохраняет белки и гликоген, чем другие осмиевые фиксаторы, и нередко дает хорошие результаты и без предварительной фиксации глутаральдегнда. Для приготовления фиксатора Мнллонига необходимы следующие растворы: 1) раствор А — 2,26'/я раствор ХаН РОхН О (стабилен в течение недели и более); 2) раствор Б— 2,52/ раствор ХаОН (хранить в полиэтиленовой бутылке при комнатной температуре, стабилен в течение длительного времени).„ 3) раствор  — 5,4'/~ раствор глюкозы (не стабилен); 4) раствор Г (фосфатный буфер Миллонига), для приготовления которого необходимо слить 41,5 мл раствора А и 8,5 мл раствора Б; 5) фиксатор— к 45 мл раствора Г добавить 5 мл раствора В и 0,5 г ОзО .
Концентрация водородных ионов (рН) распюра должна равняться 7,3 — 7,4. Четырехокись осмия очень токсична и работать с ней нужно только в вытяжном шкафу. Учитывая, что она не меняет рН раствора, проверку рН буфера следует проводить перед добавлением ОзО4. В замороженном виде фиксатор Миллонига хранится в течение нескольких недель. Перед замораживанием его можно разлить в химически чистые пенициллиновые флакончики в количествах, необходимых для фиксации одного кусочка. Альдегидиые фиксаторы. Рекомендуемое время фиксации 2— 4 ч.
Глутаральдегидовые фиксаторы можно приготовить на какодилатном буфере или на фосфатном буфере Миллонига. гз~ Глутар ал ьд егид на к а к од ил атно м буфере. Для его приготовления необходимо иметь запасной 0,2 М буферный раствор какодилата натрия (10,7 г какодилата натрия развести дистиллированной водой, довести конечный объем раствора до 250 мл) и 25% (или 50%) раствор специально стабилизированного раствора глутаральдегида для электронной микроскопии (продается как 25% и 50%). Оба раствора следует хранить при +4' С. Перед фиксацией материала берут 8 мл 25% (или 4 мл 50%) глутаральдегида, сливают с 25 мл 0,2 М какодилата натрия, доводят рН до 7,3 — 7,4, добавляя 1 М НС1. Затем добавляют дистиллированную воду до общего объема 50 мл.
В результате получается 4% раствор глутаральдегида. Хорошие результаты дает использование 2% раствора глутаральдегида. Для получения такого раствора нужно взять 4 мл 25% или 2 мл 50% раствора глутаральдегида (вместо указанных выше 8 или 4 мл). Глутаральдегидный фиксатор на фосфатном буфере Милл они га. Для его приготовления требуется раствор А — 2,26% раствор НаН РО„Н О, раствор Б — 2„25% раствор ХаОН н расвор  — 25% раствор глутаральдегида. Перед употреблением необходимо смешать 8 мл раствора В и 32 мл раствора А, довести рН до 7,3 — 7,4, добавляя постепенно раствор Б, и долить дистиллированной воды до общего объема 50 мл. Добавлять глюкозу не требуется, так как раствор уже является гипертоническим.
П ар а ф о р м а л ьд е гид н ы е фиксатор ы, как уже упоминалось, используются при гистохимическом исследовании ферментов на уровне электронной микроскопии. При этом нельзя пользоваться продажным 40% (точнее 37%) формальдегидом, а только химически чистым порошкообразным параформальдегидом. Для приготовления формальдегидного фиксатора на буфере Миллонига необходимо соединить растворы А и В фосфатного буфера Миллонига (см. выше) в следующем соотношении: раствора А 41,5 мл и раствора Б 8,5 мл.
Смесь следует нагреть до 60 — 80' С (в закрытом сосуде, чтобы избежать испарения). Добавить 2 г химически чистого порошкообразного параформальдепща. Встряхивать до полного растворения параформальдегида, профильтровать, охладить. Хранить фиксатор нельзя, он должен готовиться перед употреблением.
Промывка осуществляется в том же буферном растворе, на котором готовится фиксатор — в 3 порциях по 5 мин. Если использована двойная фиксация, то промывают после каждого употребления фиксатора, впрочем перед дофиксацией четырехокисью осмия промывку можно не проводить. ОБЕЗВОЖИВАНИЕ И ЗАЛИВКА Для электронной микроскопии необходимо получить ультратонкие срезы (40 — 80 нм). Заливка в парафин и целлоидин для получения таких срезов не подходит, необходимы более твердые среды. 232 Поэтому материал заливают в синтетические смолы, например эпоксцдные (эпон, аралднт нли различные сочетания эпона с аралдитом).
Материал заливают в жидкие эпоксидные смолы, которые затем полимеризуются и затвердевают. Обезвоживание производят в этиловом спирте возрастающей концентрации — 50/о, 60О/о, 70%, 80%, 960/о, 100О/о, 100% примерно по 10 мин в каждом. При этом не материал переносят из сосуда в сосуд, а спирт наливают в маленький флакончик (например, пенициллиновый), в котором находится материал, а затем сливают. Заливка в араадит. Для заливки необходимы следующие реактивы: 1) заливочная смола — аралдит Су212 (эквивалент аралдит 502); 2) уплотнитель — додецил-янтарнокислый ангидрид — Ну964 (синоним — 964В, ПРИ); 3) катализатор — трцдиметиламинометилфенол — 13у064 (синоним 964С, эквивалент ДМРЗО); 4) пластнфикатор — дибутилфталат.
Здесь приводятся лишь некоторые буквенные и цифровые обозначения заливочной смолы, уплотнителя и катализатора — у каждой фирмы, выпускающей наборы для заливки в аралдит, эти обозначения свои. Принципиальным является то, что в каждом наборе должны быть заливочная смола, уплотнитель, катализатор и пластификатор. Для приготовления запасного раствора среды для заливки смешивают равные объемы заливочной смолы и уплотнители. Эту смесь тщательно перемешивают, но так, чтобы не образовались пузырьки воздуха.
Смесь можно хранить в течение недель при комнатной температуре. При приготовлении заливочной среды к 20 мл запасного раствора среды добавляют 0,4 мл катализатора (ускорителя) и 0,6 мл пластификатора (дибутилфталата). При использовании какой заливочной среды получается блок средней твердости. Если желательно, чтобы блок получился более твердым, пластификатора добавляют меньше, если менее твердым — больше. Если после заливки осталась неиспользованная среда, ее можно хранить несколько недель в плотно закрытом сосуде в морозильной камере холодильника. При заливке в аралдит рекомендуется сначала проводить ткань через эпоксипропан (окись пропилена), затем помещать в смесь для заливки на срок до 24 ч.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
