Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1112199), страница 54
Текст из файла (страница 54)
При отсутствии эпоксипропана поступают следующим образом: 1) после обезвоживания в 100'/о спирте материал помещают в 3 порции безводного ацетона по 10 мин в каждой; 2) помещают материал в смесь ацетона с заливочной смесью в отношении 1:1 — 1:2 на 1 ч; 3) переносят материал для пропитки на 20— 24 ч в заливочную смесь при комнатной температуре; 4) материал помещают в полиэтиленовые капсулы, формочки или желатнновые капсулы в свежую заливочную среду и ставят для полимеризацни в термастат при 60' С на 24 ч. Желатнновые капсулы полезно перед употреблением просушить в течение 1 ч в термостате прн 60' С.
Полиэтиленовые капсулы в такой обработке не нуждаются. Запинка в эпон в модификации Люфта. Для заливки нужно иметь два запасных раствора: запасной раствор 1, для получения которого гзз нужно слить 62 мл эпона-812 и 100 мл уплотнители — РОБА (Ну964), и запасной раствор 2, содержащий 100 мл эпона-812 и 89 мл уплотнителя МХА. Из первого запасного раствора получаются очень мягкие блоки, из второго — очень твердые, поэтому используют смеси запасных растворов.
Блоки средней твердости получаются при смешивании 7 частей запасного раствора 1 с 3 частями запасного раствора 2. В заливочную среду добавляют в качестве катализатора 1:5 — 2'/«Пу064 (11МР-30). После обезвоживания материал помещают на 1 ч в смесь 100% этилового спирта с заливочной средой, затем переносят в капсулы, заполненные свежей заливочной средой, и помещают для полимеризации в термостате при 60' С на 24 ч.
ПРИГОТОВЛЕНИЕУЛЬТРАТОНКИХСРЕЗОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ Ультратонкие срезы получают на специальных приборах, называемых ультратомами. Для резки обычно используются стеклянные ножи. Ножи приготовляют или из полосок стекла, специально предназначенных для этой цели, или из зеркального стекла, которое режут на полоски соответствующей ширины. Для изготовления ножей используют специальные приборы, называемые найфмекерами, или ножи изготавливают вручную. Стеклянные ножи не следует готовить впрок, так как стекло «течет» и режущий край постепенно тупится, однако такие старые ножи можно использовать для приготовления полутонких срезов (см.
ниже). Ножи следует ставить вертикально в специальные держатели для ножей. Перед установкой ножа на ультратоме к нему нужно прикрепить «ванночку» для жидкости, на поверхности которой плавают срезы. Ванночка может быть металлической, из лейкопластыря или из винилиновой изоляционной ленты (рис. 82). Ванночку прикрепляют к ножу расплавленным воском. Полугонкие срезы. Готовят срезы толщиной 1 — 2 мкм. Они имеют два назначения: 1) хорошо окрашенные полутонкие срезы могут быть использованы для изучения на уровне световой микроскопии; 2) на полутонких срезах выбирают интересующий исследователя участок (например, определенный слой коры большого мозга), из которого затем готовят ультратонкие срезы. Как полутонкне, так и ультратонкие срезы делают на ультратомах.
Если в лаборатории два ультратома, то для получения ультра- тонких и полутонких срезов лучше использовать разные приборы. Этим достигается их лучшая сохранность. Детали инструкций, которыми надо пользоваться при резке, различны у микротомов различных типов. Во всех случаях блок подается по направлению к режущему краю ножа за счет теплового расширения нагреваемого металлического стержня, а опускание блока ниже края ножа может производиться либо вручную, либо в автоматическом режиме. Перед получением срезов необходимо провести подготовитель- 234 Рнс. 62.
Ванночки для стеклянных ножей (1) н заточка блока для ультратонких срезов (и). а — заявочна длв повумнких срезов; б — ванночка для ультратонкнх срезов; в — металлическая ванночка; 1 — васк; 2 — лента; 3 — металлическая ванночка; 4 — стеклявный иож; г — срезввиая поверхность блока; д — лицевав поверхность блока, обрезанная до размеров иужиопз для ясследования участка; е — заточенная пирамида (вид сверку); ж — заточенная пврамида (ивд сбоку); 5— нужный для исследования учжчок (по Б.
Уикли, 1975). ную работу. Если материал был залит в желатиновую капсулу, ее следует растворить в теплой воде. Полиэтиленовую капсулу разрезают с одной стороны и затем снимают. Для получения полутонких срезов блок помещают в держатель, который затем прочно закрепляют в ультратоме. Нож подводят как можно ближе к блоку, но так, чтобы он не касался блока. При каждом подъеме и опускании блока производится его подача к ножу на заданное расстояние, при резке полутонких срезов оно равно 1 — 2 мкм.
Блок скоро коснется ножа, и будет получен первый срез. В ванночку с помощью шприца с длинной иглой наливают 10% раствор ацетона в дистиллированной 235 воде (10'/ спирт или дистиллированную воду). При этом поверхность жидкости образует мениск. Если мениск слишком выпуклый, то при опускании блока жидкость будет стекать по передней стороне ножа, увлекая за собой срезы, если вогнутый — срезы не попадут на поверхность жидкости, а будут прилипать к ножу, следовательно, нужно следить за правильностью формы мениска.
Полутонкие срезы снимают с мениска кисточкой и переносят в каплю раствора ацетона на поверхности чистого предметного стекла. Стекло несколько раз проводят над пламенем горелки до тех пор, пока не испарится жидкость под срезом (она не должна закипать). Таким образом срезы расправляют и приклеивают к стеклу. О к р а ш и в а н и е полутонких срезов можно производить метиленовым синим. Для этого на стекло с высушенными срезами наносят одинаковое число капель 1% раствора метиленового синего и 1'/ч раствор буры, быстро проводят стекло раз десять над пламенем газовой горелки (краска не должна закипать). Срезы следует промыть тонкой струйкой горячей водопроводной воды и протереть обратную сторону стекла чистой тряпочкой.
Такой способ окрашивания полутонких срезов рекомендуется из-за его быстроты. Он может быть полезен при выборе нужного учасгка блока для получения ультратонких срезов. Более стабильные результаты дает окрашивание при комнатной температуре в течение 30 мин в смеси равных объемов 1'/ч растворов метиленового синего и буры. Препарат с окрашенным полутонким срезом можяо сразу посмотреть под микроскопом и выбрать участок для получения ультратонких срезов, после чего можно заточить блок таким образом, чтобы на нем остался лишь интересующий участок. При этом блок закрепляют в держателе срезанной поверхностью вверх и помещают под стерео- микроскоп (бинокулярную лупу) так, чтобы ткань в нем была хорошо видна.
Препарат с полутонким срезом поворачивают на предметном столике микроскопа таким образом, чтобы ткань на срезе занимала такое же положение, как в блоке. С помощью бритвенного лезвия обрезают блок так, чтобы поверхность резки содержала только участок, предназначенный для исследования. Все остальное почти полностью удаляют. Блок следует заточить в форме четырехгранной пирамиды с плоской вершиной, которая и будет поверхностью резки (см.
рис. 82). После этого можно приступать к получению ультратонких срезов. Ультратоикие срезы. Их получают так же, как и полутонкие. В ванночку, прикрепленную к ножу, наливают 10'/~ раствор ацетона„ 10% этиловый спирт и дистиллированную воду. Толщину срезов регулируют с помощью соответствующей ручки настройки микро- тома. Ручка обычно снабжена шкалой, указывающей толщину среза, но ее показания приблизительны.
Определять толщину среза можно по его цвету. Серебристо-серые срезы имеют толщину 50— 60 нм — это вполне подходящая для электронной микроскопии толщина. Толщина серебристых срезов 60 — 90 нм, золотистых — 90— 120 нм. Срезы толщиной 90 — 120 нм можно использовать, но они не 236 годны для работы с высоким разрешением. Темно-золотистые, пурпурные, синие, зеленые срезы не годны, так как они слишком толстые. Все срезы тоньше 50 нм серого цвета, получить их трудно, и не всегда нужно к этому стремиться„так как при исследовании в электронном микроскопе очень тонкие срезы легче рвутся.
Некоторые погрешности при получении срезов и способы их исправления. Припоявлении царапины на срезе нужно немного передвинуть нож. Если царапина при этом появляется на том же месте, значит, она зависит не от зазубрины на ноже, а от чего-то твердого в самом блоке. Горизонтальная исчерченносгь (следы вибрации) на срезах может быть вызвана тем, что блок не был прочно закреплен в блокодержателе, а блокодержатель — в ультратоме, или слишком большим углом наклона ножа. Вибрация может также зависеть от несоответствия твердости блока и скорости резания: чем тверже блок, тем ниже должна быть скорость резания. Если все указанные причины отсутствуют, причину вибрации следует искать внутри или вне здания. С н я т и е с р е з о в.
Ультратонкие срезы располагаются на мениске жидкости ленточкой или могут плавать отдельно. Их вьиавливают на медную сеточку диаметром 3 мм. Срезы тканей, залитых в аралдит или эпон, часто помещают на сетки без подложки, но в некоторых случаях на сетку натягивают поддерживающую пленку — подложку. Отдельные срезы перед вылавливанием можно расположить определенным образом на поверхности жидкостис помощью ресницы, прикрепленной к концу деревянной палочки. Сеточку берут тонким пинцетом и опускают ее прямо на срезы. Одна сторона сеточки полированная„другая матовая. Какой стороной опускать сеточку на срезы — безразлично, но нужно всегда опускать одной и той же стороной — либо матовой, либо блестящей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
