Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (1105762), страница 14
Текст из файла (страница 14)
В случае необратимо связывающегосяковалентного ингибитора β1i-специфического пептидилэпоксикетона на рисунке представлена постепенноснижающаяся интенсивность люминесценции после добавления ингибитора, пропорциональная скоростигидролиза пептидного субстрата. Линии на рисунках В были получены аппроксимацией экспериментальныхданных нелинейным методом наименьших квадратов к уравнению 2 (см. материалы и методы). Г.Воздействие ингибиторов протеасомы на гидролиз MBP in vitro 26S протеасомой из головного мозга мышейSJL-EAE.75Рисунок 33.
Химотрипсин-подобная активность протеасомы (в процентах от активности протеасомы, необработанной ингибиторами) при воздействии 1% ДМСО (контроль), 1 мкМ PS-341, 1 мкМ MG-132 и 1мкМ β1i-специфического пептидилэпоксикетонаНа конечном этапе была протестирована способность ингибиторов PS-341 и β1iспецифического пептидилэпоксикетона подавлять развитие EAE у мышей линии SJL.Мышей с индуцированным ЕАЕ разделили на группы согласно таблице 4. Указанныепрепараты вводили внутривенно в хвостовую вену 2 раза в неделю с первого по 21й деньпосле иммунизации.
Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что β1iспецифическийпептидилэпоксикетонснижаеттяжестьпротеканиязаболеванияэффективнее, чем PS-341 в той же дозировке (0.5 мг/кг) (Рис. 34).Таблица 4. Терапия ЕАЕ ингибиторами протеасомы у мышей линии SJL.ГруппаКоличествомышейИнгибиторДоза,мг/кгОбъеминъекции,мклВключаяДМСО,мклВведение*Иммунизация110PS-3410.525010++2101i-PEk0.525010++310––25010++45––25010+–55–––0–+65–––0––*2 раза в неделю с дня 0 до дня 21 после иммунизации76Рисунок 34. Развитие EAE у мышей линии SJL без терапии и при введении ингибиторов PS-341 и β1iспецифического пептидилэпоксикетона в дозе 0,5 мг/кг 2 раза в неделю в течение 21 дня послеиммунизации.Как уже упоминалось ранее, ингибиторы протеасомы в настоящее время активноисследуются как потенциальные терапевтические средства против аутоиммунныхзаболеваний. В работе [139] показано, что ингибитор PR-957, специфический к β5iкаталитической субъединице иммунопротеасомы, снижает тяжесть течения заболевания ипредотвращает возникновение обострений при ЕАЕ у мышей линии C57BL/6,иммунизированных MOG35–55 или PLP139–151.
Терапевтический эффект в этом случаеобусловлен воздействием на клетки иммунной системы, благодаря высокому содержаниюв них именно иммуносубъединицы β5i. Преимущественная локализация β5i винфильтрирующих лимфоцитах также была подтверждена и в настоящей работе. Исходяиз его мишени, механизм действия PR-957 заключается в подавлении миграцииактивированных лимфоцитов, в особенности CD4+ T-хелперов, и активированныхмиелоидныхклетоквЦНСэкспериментальныхживотных;блокированиидифференциации CD4+ Т-клеток в Th1 и Th17, увеличении количества регуляторных Тклеток (Treg), а также в снижении продукции ряда цитокинов.
Очевидно, что подобноепротективное действие сопровождается рядом системных осложнений, вследствиенеспецифического угнетения функций иммунной системы в целом. Выполненные намиэксперименты наглядно демонстрируют, что при развитии EAE иммунопротеасома волигодендроцитах содержит преимущественно субъединицу β1i. На основании этогофактаможноингибиторапредположить,основаноначтотерапевтическоеингибированиидействиепродукцииβ1i-специфическогоантигенныхпептидовволигодендроцитах, что препятствует их узнаванию цитотоксическими T-лимфоцитами,нежели на подавлении функций Т-лимфоцитов как таковых.
Таким образом, применение77β1i-специфического ингибитора потенциально может быть более предпочтительным сточки зрения безопасности клинического применения.78МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.Химические реактивы и сопутствующие материалы.В работе использовали следующие реактивы и материалы:Основные реактивы: трис-гидроксиметиламинометан (трис), персульфат аммония,тетраборат натрия, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), одно- и двузамещенныйфосфат натрия, хлорид натрия, ацетат натрия, хлорид магния, глицин, -меркаптоэтанол,диметилсульфоксид (ДМСО), дитиотреитол (DTT), аденозин-5’-трифосфат (АТФ),креатинфосфат(SigmaСША);Aldrich,акриламид,N`,N`-метиленбисакриламид,додецилсульфат натрия (SDS), мочевину sequence grade, нитроцеллюлозную мембрануHybond C extra (Amersham, США); nonidet P-40 (NP40) (Difco, Великобритания), ядерныйкраситель Hoeсhst 33342 (Life Technologies, США).
Остальные реактивы отечественногопроизводства марки “осч” (особо чистые).Вода, содержащая атом кислорода с массовым числом 18, была произведена вНациональном исследовательском ценре «Курчатовский институт».Генетическая конструкция, кодирующая рекомбинантный основной белок миелиначеловека, была получена ранее в лаборатории биокатализа ИБХ РАН А.А.Кудряевой иТ.В.Бобик. Генетические конструкции, кодирующие убиквитин с HA и myc эпитипами,K0-убиквитин с HA и myc эпитопами, c-Myc с HA-эпитопом, были любезнопредоставлены Dr. Kazuhiro Iwai (Высшая школа Медицины, Университет Осака, Осака,Япония). Генетические конструкции, кодирующие p105 с FLAG-эпитопом и Ubc6, былалюбезно предоставлена Dr.
Aaron Ciechanover (Лаборатория метаболизма белка, Технион,Хайфа,Израиль).Генетическаяконструкция,кодирующаярекомбинантнуюорнитиндекарбоксилазу с FLAG-эпитопом, была любезно предоставлена Dr. ChaimKahana (Вайзманн институт, Реховот, Израиль).Малые интерферирующие РНК к убиквитин-лигазе E1, а также некодирующая siRNAбылипроизведеныинтерферирующиеDharmaconРНКкRNAi,GEсубъединицамHealthcare,протеасомыВеликобритания.былиМалыесинтезированывсотрудничестве с профессором Е.Л.Черноловской (Институт химической биологии ифундаментальноймедицины Сибирскогоотделения РоссийскойАкадемии наук,Новосибирск).Ферменты: креатинфосфокиназа из мышц кролика, трипсин из поджелудочной железыкоровы, химотрипсин из поджелудочной железы коровы, рекомбинантная матриксная79металлопротеаза 3 (MMP-3), рекомбинантная матриксная металлопротеаза 9 (MMP-9),кальпаин из плазмы крови человека, коллагеназа D из Сlostridium histolyticum (Roche LifeScience, Германия), ДНКаза из поджелудочной железы коровы (Sigma Aldrich, США).Другие белки: ингибитор трипсина из соевых бобов (GERBU Biotechnik GmbH,Германия), бычий сывороточный альбумин, актин из мышц свиньи, лизоцим из куриногояйца, кальмодулин из мозга коровы (Sigma Aldrich, США), рекомбинантный убиквитин,рекомбинантный K-48 тетраубиквитин, рекомбинантный метилированыйубиквитин(Boston Biochem, США), копаксон (глатирамера ацетат) (Teva, Израиль), маркерымолекулярной массы белков Protein Molecular Weight Marker 14.4-116.0 кДа, PrestainedProtein Molecular Weight Marker 19.0-118.0 кДа (Fermentas, Литва).
РекомбинантныйгистонH1.3любезнопредоставленП.Кругляковым(ЗАО«Фармсинтез»).Рекомбинантный тиоредоксин получен в лаборатории биокатализа Степановым А.В.Ингибиторы и субстраты протеасомы: MG132 (карбоксибензоил-L-лейцил-L-лейцил-Lлейциналь) (Boston Biochem, США), ингибитор протеасомы PS-341 (PS-341) (LClaboratories, США), β5i-специфический пептидилэпоксикетон был синтезирован в группесинтеза природных соединений ИБХ РАН под руководством И.В.Ямпольского пометодике, описаной в [21], субстрат N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Sigma Aldrich,США),наборыдляопределениятрипсин-подобной,химотрипсин-подобнойикаспазоподобной протеолитической активности протеасомы Proteasome-Glo kits (Promega,США)Реактивы для получения клеточных культур и культивирования клеток: рекомбинантныеинтерлейкин-2рекомбинантныйиинтерлейкин-7цилиарныймыши,селенитнейротрофическийнатрия,апо-трансферрин,фактор (CNTF), рекомбинантныйинсулин, биотин, гидрокортизон, трийодтиронин (T3), рекомбенантный интерферн-гаммамыши и человека (Sigma Aldrich, США).
Ростовые среды DMEM, opti-MEM и advancedRPMI, фетальная бычья сыворотка (Gibco, США), раствор гентамицина (ПанЭко, Россия),раствор фиколла Ficoll Paque Plus (GE Healthcare, Великобритания), набор для выделенияCD8+ Т-клеток мыши Dynabeads® Untouched™ Mouse CD8 Cells Kit (Life Technologies,США).Эукариотическиеклетки:клеткилинийHEKиHeLa,первичныекультурыолигодендроцитов, мононуклеарных клеток переферической крови, СD8+ Т-лимфоцитови дендритных клеток мыши (получение первичных культур описано в разделе «методы»)80Антитела и конъюгаты: антитела к c-myc эпитопу, продуцируемые гибридомой C-MYC,антитело мыши к β-актину, антитело крысы к CD3 (Santa Cruz Biotechnology, США),антитела мыши к субъединицам протеасомы Rpt6, α, β5, антитела кролика к субъединицампротеасомы β1i, β5i , β1, Rpn13, антитела кролика к убиквитин-лигазе E1 и кполиубиквитиновым конъюгатам (Enzo life sciences, США), антитела мыши к маркеруолигодендроцитов О4, антитела козы к Fc-фрагменту IgG мыши, конъюгированные спероксидазой хрена, антитела козы к IgM мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена,антитела козы к IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена, антитела кролика кMBP, антитела мыши к FLAG-эпитопу, конъюгированные с пероксидазой хрена, (SigmaAldrich, США), антитела осла к IgG кролика, IgG крысы, IgG мыши и IgM мыши,конъюгированые с флуоресцентными красителями (Alexa 405, Alexa 488, Alexa 594) (LifeTechnologies, США), антитела мыши к NeuN (Millipore, США), антитела крысы к MBP,антитела кролика к MBP, конъюгированные с пероксидазой хрена, антитела кролика ксубъединице протеасомы Rpn10, антитела курицы к HA-тэгу, конъюгированные спероксидазой хрена (Abcam, Великобритания).Животные: мыши линии Balb/c, мыши линии SJL, мыши линии C3H, мыши линииC57BL/6 (Питомник ФИБХ г.Пущино, Россия); мыши линии SJL (Harlan, Израиль).РастворыВсе растворы готовились на дистиллированной воде или на воде особой чистоты изустановки “Milli-Q” (Millipore).PBS: 8.0 г/л NaCl, 0.2 г/л KCl, 1.15 г/л Na2HPO4, 0.2 г/л KH2PO4, рН 7.2.TBS: 20 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7.5Конъюгатный буфер для вестерн-блоттинга: TBS, 0,5% BSA или обезжиренное сухоемолоко, 0.05% Tween-20.Двухкратный буфер нанесения образцов для электрофореза по Леммли: 5% 2меркаптоэтанола, 4% SDS, 0.25 М Трис–HCl, pH 6.8; 4 мМ ЭДТА, 10% глицерина, 0.25мг/мл бромфенолового синего.Пятикратный электродный буфер для электрофореза по Леммли: глицин 72 г/л, SDS 5 г/л,Трис-HCl 6.5 г/л, pH 8.3.Буфер переноса для иммуноблоттинга: 39мМ глицин, 48мМ Трис-HCl, 0.0375% SDS, 20%этанола.81Буфер для нативного электрофореза: 0.09 M Tris (pH 8.3), 0.09M H3BO3, 5 мM MgCl2, 1мM ATФ, 1 мM DTTKRB (Буфер Кребса-Рингера): 122мМ NaCl, 5мМ KCl, 1мМK2HPO4, 25мМ NaHCO3,14мМ глюкоза, 0,01мг/мл феноловый красный.Буферные растворы для выделения протеасомы:Буфер А: 20 мМ Трис-HCl, 100мМ NaCl, 1mM ЭДТА, 5мМ MgCl2, 1мМ DTT, 2мМ АТФ,10% глицерина, pH 7.5.Буфер Б: 20мМ Трис-HCl, 250мМ NaCl, 1мМ ЭДТА, 5мМ MgCl2, 1мМ DTT, 1мМ АТФ,20% глицерина, pH 7.5.Буфер Г: 20 мМ Трис-HCl, 1мM ЭДТА, 5мМ MgCl2, 1мМ DTT, 1мМ АТФ, pH 7.5.Буфер Е: 20 мМ Трис-HCl, 0.1мM ЭДТА, 1мМ DTT, 0.1мМ АТФ, 10% глицерина, pH 7.8.Буфер для хранения протеасомы: буфер Г + 10% глицерина.Работа с белкамиДенатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле.Электрофорез проводили по стандартной методике Лэммли [178].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
