Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (1105762), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Клетки линии HEK трансфицировали генетическими конструкциями, кодирующими белки,указанные в таблице вверху, лизировали и подвергали иммунопреципитации анти-FLAG антителом.Исходные лизаты (слева) и соответствующие им элюаты после иммунопреципитации (справа)анализировали методом вестерн-блоттинга с окрашиванием анти-FLAG и анти-HA антителами. ПААГ –полиакриламидный гель, IgG – присутствующее в элюате анти-FLAG антитело, IgG Hc – его тяжелая цепь,IgG Lc – его легкая цепь.Чтобы определить, необходимо ли полиубиквитинилирование для гидролиза MBPпротеасомой, были проведены дополнительные эксперименты с использованиемгенетической конструкции, кодирующей вариант убиквитина K0 (UbK0), а также малымиинтерферирующими PHK, блокирующими экспрессию убиквитин-лигазы E1 (E1 siRNA).49UbK0 – это вариант убиквитина, в котором все остатки лизина заменены на остаткиаргинина, и вследствие этого он не способен образовывать полиубиквитиновые цепи [40].E1–этоубиквитин-активирующийубиквитинилирования,которыйполиубиквитинилирования[31].фермент–ключевойосуществляетКлеткилинииHEKферментсистемыпраймингбыликаскадатрансфицированыгенетическими конструкциями, кодирующими UbK0 или убиквитин дикого типа (Ub WT),слитных с myc эпитопом (Рис.
15А и 15Б). Во втором случае клетки былитрансфицированы E1 siRNA или иррелевантной siRNA в качестве контроля (Рис. 15В и15Г). Спустя 24 часа клетки были повторно трансфицированы генетическимиконструкциям, кодирующими белки MBP, с-Myc или орнитиндекарбоксилазу (ornithinedecarboxylase, ODC) и еще спустя 24 часа анализировали внутриклеточный протеолиз сиспользованиемциклогексимида.C-MycиODCбыливыбранывкачествефункциональных контролей, т.к. гидролиз белка с-Myc протеасомой протекает поклассическому убиквитин-зависимому пути [149], в то время как ODC протеолизуется поубиквитн-независимому пути с участием вспомогательного белка антизима [150].
Как иожидалось, котрансфекция как UbК0, так и E1 siRNA к E1 блокировала протеасомальныйгидролиз белка с-Myc и способствовала его накоплению, в то время как протеолиз ODCпротеасомой в этих условиях не изменялся по сравнению с контрольной трансфекцией.Более того, в отсутствии полиубиквитинилирования вследствие котрансфекции UbK0протеолиз ODC протекал существенно быстрее, чем при котрансфекции убиквитиномдикого типа, предположительно из-за отсутствия конкуренции с полиубиквитиновымиконъюгатами за взаимодействие с протеасомой.
MBP подвергался протеолизу содинаковойскоростьювовсехусловиях,чтосвидетельствуетоботсутствиинеобходимости в модификации MBP убиквитином для его гидролиза протеасомой.50Рисунок 15. A. Вестерн-блоттинг лизатов клеток линии HEK, трансфицированных генетическимиконструкциями, кодирующими вариант убиквитина K0 (UbK0) или убиквитин дикого типа (UbWT),слитных с myc-эпитопом, а также генетическими конструкциями, кодирующими MBP (rhMBP-Flag), с-Myc(HA-c-Myc) или орнитиндекарбоксилазу (ODC-Flag). Здесь и далее приведены различные временные точкиобработки клеток циклогексимидом.
В качестве контроля процедуры нанесения применяли гибридизациюэтой же мембраны с моноклональными антителами к β-актину (актин). Б. Вестерн-блоттинг тех жеклеточных лизатов, что и в (А), гибридизация с анти-myc антителом для наблюдения за накоплением ипротеолизом полиубиквитиновых конъюгатов. В. Вестерн-блоттинг лизатов клеток линии HEK,трансфицированных генетическими конструкциями, кодирующими MBP, с-Myc или ODC, а такжеконтрольной siRNA и E1 siRNA. Г.
Вестерн-блоттинг тех же клеточных лизатов, что и в (В), гибридизация сантителом к лигазе Е1.Аналогичные эксперименты были проведены на первичной культуре зрелыхолигодендроцитов мыши. Олигодендроциты были котрансфицированы генетическимиконструкциями, кодирующими белки MBP или c-Myc, вместе с генетическимиконструкциями, кодирующими UbK0 или Ub дикого типа. По аналогии с клетками HEK, вприсутствии UbK0 MBP гидролизовался с такой же скоростью или даже несколькобыстрее, чем в присутствии убиквитина дикого типа, в то время как подавлениеполиубиквитинилирования блокировало протеолиз белка c-Myc (Рис. 16). Полученныеданные свидетельствуют о том, что MBP может быть гидролизован протеасомой поубиквитин-независимому пути.51Рисунок 16.
Протеолиз MBP в культуре олигодендроцитов. Вестерн-блоттинг лизатов олигодендроцитов,трансфицированных генетическими конструкциями, кодирующими вариант убиквитина K0 (UbK0) илиубиквитин дикого типа (UbWT), слитных с myc эпитопом, а также генетическими конструкциями,кодирующими белки rhMBP-Flag или HA-c-Myc. pUb. – гибридизация с антителом, специфичным кполиубиквитиновым конъюгатам.Протеолиз MBP 26S протеасомой in vitroДля анализа компонентов, необходимых для протеасомной деградации МВР in vitro,мы использовали систему на основе S100 экстракта из клеток линии HeLa, а также изголовного мозга мышей линии BALB/c (Рис.
17А). S100 экстракт из головного мозгаиспользовался вследствие того, что экспрессия гипотетически существующей убиквитинлигазы Е3, обладающей сродством к МВР, может быть тканеспецифичной. В результатепроведенных экспериментов заметного количества конъюгатов MBP с убиквитином ненаблюдалось, хотя, судя по образованию полиубиквитиновых конъюгатов с другимибелками, система in vitro убиквитинилирования была полностью функциональна.Незначительное количество моно- и диубиквитинилированных производных MBPобразовывалось только в присутствии убиквитин-альдегида, ингибитора убиквитинизопептидаз и других деубиквитинилирующих ферментов [151].
Скорость гидролиза MBP26S протеасомой in vitro в присутствии системы убиквитинилирования не изменялась придобавлении убиквитина (Рис. 17Б). Существует вероятность, что в S100 экстракте ужесодержится следовое количество молекул убиквитина, достаточное для протеканияреакцииполиубиквитинилирования.Вэтойсвязи,чтобыполностьюподавитьнаращивание убиквитиновой цепи, был проведен аналогичный эксперимент с введением вреакцию избыточного количества убиквитина, метилированного по остаткам лизина ивследствие этого не способного образовывать полиубиквитиновые конъюгаты (Рис.
17B).52Скорость гидролиза MBP 26S протеасомой in vitro в присутствии метилированногоубиквитина была сравнима с таковой в случае немодифицированного убиквитина. Вподобныхслучаяхостаетсятеоретическаявозможностьдостаточностимоноубквитинилирования или поли-моноубиквитинилирования [40] для гидролизасубстрата протеасомой. Для проверки данной гипотезы был проведен эксперимент по invitro протеолизу МВР в максимально упрощенной системе: индивидуальная 26Sпротеасома с очищенным белковым субстратом в присутствии АТР (Рис. 17Г). 26Sпротеасому выделяли из головного мозга мыши по методике, включающей осаждение40% сульфатом аммония, гель-фильтрацию и анионообменную хроматографию, чтоисключает присутствие каких-либо компонентов системы убиквитинилирования.
MBPгидролизовался подобной высокоочищенной 26S протеасомой в отличие от других белков– BSA, тиоредоксина и лизоцима, которые не подвергались протеолизу даже после 24часов инкубации.Полученные результаты свидетельствуют, что убиквитин-независимый протеолизMBP возможен при физиологически значимых концентрациях MBP. По даннымлитературы [152], накопление MBP в олигодендроцитах происходит со скоростью 0,2фмоль в сутки на одну клетку, и достигает динамического равновесия при количествеMBP 1 фмоль на 1 клетку. Известно, что объем зрелого олигодендроцита составляетпримерно 1.7 пл [153]. Если допустить, что в свободном виде в клетке присутствует неболее 10% от всего MBP, то его концентрация будет составлять 60 мкМ или меньше, в товремя как в проведенных нами экспериментах начальная концентрация MBP составляла 520 мкМ.53Рисунок 17.
А. Вестерн-блоттинг продуктов реакции in vitro убиквитинилирования. Состав реакционнойсмеси для каждого случая обозначен в таблице сверху: bovMBP – MBP из мозга коровы, HeLa – S100экстракт из клеток линии HeLa, S100-BALB/c – S100-экстракт из головного мозга мышей линии BALB/c,UbAl – убиквитин-альдегид, Ub-убиквитин.
Приведена гибридизация с антителами, специфичными к MBP(вверху) и полиубиквитиновым конъюгатам (внизу) Б. Гидролиз MBP 26S протеасомой in vitro вприсутствии системы убиквитинилирования с добавлением (сверху) без (снизу) убиквитина. В. ГидролизMBP 26S протеасомой in vitro в присутствии системы убиквитинилирования с добавлениемнемодифицированного (Ub) и метилированного (MeUb) убиквитина Г. (i) Электрофоретическое разделениев ПААГ гидролизатов различных белков очищенным препаратом 26S протеасомы (ii) Анализ составасубъединичного состава очищенных препаратов протеасомы, сверху-вниз электрофоретическое разделениев нативном и денатурирующих ПААГ, вестерн-блоттинг с использованием соответствующих антител.Изучение влияния заряда МВР на эффективность убиквитин-независимогопротеолизаДля того, чтобы попасть в каталитическую полость протеасомы и подвергнутьсягидролизу, белок должен связаться с регуляторной 19S субъединицей протеасомы.
Вслучае убиквитинилированных субстратов это взаимодействие происходит путемвзаимодействия убиквитиновых конъюгатов с 19S субъединицей. MBP обладает высоким54положительным зарядом и является структурно неупорядоченным белком [154], поэтомуможно предположить, что его связывание с другими белками определяется, в основном,электростатическими и/или гидрофобными взаимодействиями.
Чтобы получить формыMBP, обладающие меньшим положительным зарядом, MBP был ацетилирован уксуснымальдегидом или ферментативно деиминирован с применением пептидиларгинилдеиминазы (PAD) (Рис. 18). Об уменьшении положительного заряда полученных формMBP свидетельствует их сниженная скорость миграции в электрическом поле припроведении электрофореза в неденатурирующих условиях, а также изменившееся времяих удерживания на колонке при проведении обращенно-фазовой хроматографии.Скорость гидролиза как ацетилированного, так и деиминированного MBP очищеннымпрепаратом26Sпротеасомысущественнозамедляетсяпосравнениюснемодифицированным природным MBP, что свидетельствует о том, что возможностьубиквитин-независимого протеолиза MBP по-видимому в первую очередь обусловленабольшим положительным зарядом этого белка.Рисунок 18.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
