Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (1105762), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Снижение поверхностного положительного заряда MBP путем ацетилирования (слева) идеиминирования (справа) и гидролиз полученных модифицированных форм MBP очищенным препаратом26S протеасомы. Степень протеолиза определяли электрофоретическим разделением реакционной смеси вПААГ с последующим денситометрическим анализом.Другим очевидным способом нейтрализации высокого положительного заряда MBPявляется образование комплексов MBP с различными белками, которые частично55компенсируют его высокий заряд. Известно, что MBP как in vitro, так и ex vivo можетобразовывать комплексы с рядом белков, например актином [155], кальмодулином [156], атакже белками, содержащими SH3-домен [157].
Кроме того, логичным представляется,что на скорость гидролиза MBP протеасомой могут влиять белки, похожие на MBPналичием высокого положительного заряда и неупорядоченной структуры, т.к. они могутконкурировать с MBP за взаимодействие с 26S протеасомой.Таблица 2. Физико-химические свойства проанализированных белковБелокМасса, кДаИзоэлектрическая точка (pI)MBP18,311,28Актин41,85,23GST23,26,28Убиквитин (Ub)8,67,37BSA66,45,6Глатирамера ацетат (GA)5-910,3Гистон H1.322,2211,02Тетраубиквитин (Ub4)34,46,56Кальмодулин (CaM)16,74,09Лизоцим (Lys)14,311,35В таблице 2 представлены белки, влияние которых на гидролиз MBP протеасомой былопротестировано в эксперименте in vitro.
Актин и кальмодулин (CaM) способныобразовывать комплексы с MBP; глатирамера ацетат (GA) – синтетический полипептид,имеющий структурное сходство с MBP, известное терапевтическое средство противрассеянного склероза [115]; гистон H1.3 по аналогии с МВР обладает положительнымзарядом и является структурно неупорядоченным белком [158]; тетраубиквитин (Ub4)является классическим лигандом регуляторной субчастицы протеасомы [33, 159, 160]. Вкачестве контрольных были выбраны белки с упорядоченной глобулярной структурой:глутатион-S-трансфераза (GST) и BSA, обладающие слабым отрицательным зарядом, иположительно заряженный лизоцим.
Скорость гидролиза MBP протеасомой в присутствииразличныхразделениемконцентрацийвыбранныхбелковопределялиэлектрофоретическимреакционных смесей в ПААГ с последующим денситометрическиманализом (Рис. 19А и 19Б). Ни тетраубиквитин, взаимодействующий с UIM-доменамисубъединицы протеасомы Rpn10 [159], ни моноубиквитин, взаимодействующий с Nконцевой частью субъединицы Rpn13 [33] не влияли на скорость гидролиза MBP56протеасомой, что позволяет предположить, что взаимодействие MBP с убиквитинсвязывающими доменами 19S регуляторной субчастицы не является необходимым для егопротеасомного гидролиза.
Присутствие GST, BSA или лизоцима не влияло на скоростьгидролиза MBP, в то время как актин, кальмодулин, гистон H1.3 и GA ингибировалипротеолиз MBP протеасомой. В дальнейшем методом поверхностного плазмонногорезонанса нами было установлено, что MBP взаимодействует с актином, но несвязывается с GA и гистоном H1.3. (Рис. 19В), в то время как 26S протеасомавзаимодействовала с GA и гистоном H1.3, но не взаимодействовала с актином. Такимобразом, белки, способные ингибировать гидролиз MBP, разделились на 2 подгруппы помеханизму своего действия – (1) взаимодействующие с MBP и (2) взаимодействующие спротеасомой. Интересно отметить, что гистон Н1.3 также протеолизуется 26Sпротеасомой in vitro, хотя и с небольшой скоростью, в то время как GA стабилен вприсутствии 26S протеасомы (Рис.
19Г).Рисунок 19. А, Б. Электрофореграммы разделения в ПААГ продуктов гидролиза MBP 26S протеасомой invitro в присутствии различных концентраций ряда белков. Ниже представлен денситометрический анализполосы на геле, соответствующей остаточному MBP. B. Анализ связывания актина, гистона Н1.3 и GA сMBP (вверху) и 26S протеасомой (внизу). Г. Электрофореграммы разделения в ПААГ продуктов гидролизаМВР 26S протеасомой in vitro. Указаны времена инкубации и приведен денситометрический анализ (внизу).57Полученные данные были подтверждены и в случае внутриклеточного протеолиза МВРпротеасомой.
Так, протеолиз MBP замедлялся в клетках линии HEK при котрансфекциигенетическими конструкциями, кодирующими MBP и гистон H1.3. Аналогично,добавление GA в культуральную среду также замедляло протеолиз MBP (Рис. 20).Рисунок 20. А. Вестерн-блоттинг анализ лизатов клеток линии HEK, трансфицированных генетическойконструкцией, кодирующей MBP. Анализ скорости протеолиза с использованием циклогексимида вприсутствии и в отсутствии 0.1 мг/мл GA в клеточной среде. Б.
Вестерн-блоттинг лизатов клеток линииHEK, трансфицированных генетическими конструкциями, кодирующими MBP, гистон Н1.3 и GFP. GFPиспользовался в качестве балластной ДНК для выравнивания общего количества трансфицируемой ДНК.Анализ скорости протеолиза с использовнием циклогексимида. Внизу представлены результатыденситометрического анализа.Известно, что MBP взаимодействует с актином не только in vitro, но и в живойклетке [161], кроме того, он способен связываться с кальмодулином, ассоциированным сионами кальция [156]. Кальмодулин в клетке взаимодействует с большим количествомбелков,включаякиназу легкихцепеймиозина,фосфодиэстеразу, при этом концентрация свободногокальцинейрин,NO-синтазу иCa2+- кальмодулина составляетвсего 50-60 нМ и явно недостаточна для защиты MBP от гидролиза протеасомой [162,163].
Физиологическая концентрация актина, способного к взаимодействию с MBP,значительно больше, т.к. MBP способен взаимодействовать не только с мономернымактином, но и с актиновыми филаментами. Однако, как показывают проведенные в58данной работе эксперименты на культурах клеток млекопитающих, такой концентрациитем не менее недостаточно для того, чтобы полностью защитить MBP от гидролизапротеасомой в живой клетке. Крайне маловероятно, что защита MBP от гидролизапротеасомой вносит свой вклад в терапевтическое действие GA, т.к. этот полипептидплохо проникает через ГЭБ и тем более через мембрану олигодендроцитов [164]Анализ физиологической значимости деградации МВРиммунопротеасомойИзучение баланса протеасома-иммунопротеасома в ЦНС при развитии ЕАЕ.Известно, что 26S протеасома может существовать в двух основных состояниях, ввиде так называемой конститутивной и иммунной протеасомы (иммунопротеасома).Смещение баланса в сторону последней происходит под действием интерферона-гамма.Как правило, при расщеплении белков иммунопротеасомой за счет измененнойспецифичности каталитических субъединиц образуется значительно большее количествопептидов, С-конец которых благоприятствует презентации на MHC I, чем прирасщеплении тех же белков стандартной протеасомой [19, 23].
Рассеянный склероз и EAEхарактеризуются развитием воспаления в ЦНС, что сопровождается повышением уровняпровоспалительных цитокинов, в том числе интерферона-гамма [165]. Поскольку,согласно нашим данным, гидролиз MBP не контролируется системой ферментовубиквитинилирования, качественный и количественный спектр пептидных фрагментовMBP, презентированных на MHC I, практически полностью зависит от составакаталитических субъединиц протеасомы.Чтобы выяснить, как меняется баланс конститутивной и иммуннопротеасомы в ЦНСпри развитии аутоиммунной патологии, мы исследовали содержание субъединицконститутивной протеасомы β1/β5, и соответствующих им иммуносубъединиц β1i/β5i вразличных отделах головного мозга контрольных мышей линии BALB/c, мышей линииSJL, предрасположенных к развитию EAE, и мышей линии SJL, развивающих ЕАЕвследствие иммунизации (Рис.
21А). Выяснилось, что содержание иммуносубъединицпротеасомы во всех отделах головного мозга значительно повышается у мышей линии SJLпри развитии ЕАЕ. Кроме того, статистически значимое увеличение содержанияиммуносубъединиц протеасомы в коре, стриатуме и медиабазальном гипоталамусе (МБГ)наблюдалось у неиммунизированных мышей линии SJL (Рис. 10Б) в сравнении с мышамилинии BALB/c.
Интересно отметить, что иммунизация мышей линии BALB/c приводила к59увеличению содержания иммунопротеасомы в мозжечке и стволе мозга – отделах,характеризующихся повышенной проницаемостью ГЭБ (Рис. 10В). Таким образом, как умышей линии SJL, так и у мышей линии BALB/c в результате иммунизацииувеличивалось количество иммунопротеасомы в ЦНС, но только у мышей линии SJLиммуносубъединицы протеасомы появлялись в отделах головного мозга, в нормезащищенных ГЭБ.60Рисунок 21. А. Вестерн-блоттинг гомогенатов различных отделов головного мозга мышей на предметналичия субъединиц конститутивной (β1/β5) или иммунной протеасомы (β1i/β5i).
МБГ – медиабазальныйгипоталамус. Б. Денситометрический анализ количества субъединиц протеасомы и β-актина как контролянанесения по результатом вестерн-блоттинга. **- статистически значимое различие. В. Вестерн-блоттинггомогенатов различных отделов головного мозга мышей линии BALB/c,иммунизированных и неиммунизированных MBP на предмет наличия субъединиц иммунной протеасомы (β1i/β5i)61Локализация иммуносубъединиц иммунопротеасомы в структурах головного мозгана клеточном уровнеДлялокализациииммунопротеасомывЦНСнамибылопроведеноиммуногистохимическое исследование срезов головного мозга экспериментальныхмышей. У мышей, больных ЕАЕ, повышение экспрессии субъединицы β1i в тканях ЦНСкоррелирует с пониженной окраской на NeuN (Рис.
22А и 22Б), что свидетельствует оапоптотических процессах в нейронах [166]. Данное наблюдение прямо указывает насвязь между нейродегенерацией и активностью иммунопротеасомы. Интересно, чтодальнейшее изучение локализации β1i и β5i в ЦНС мышей с ЕАЕ, показало присутствиеэтихиммуносубъединицвразличныхтипахклеток(Рис.22В).Детальныйгистохимический анализ продемонстрировал, что β1i колокализуется с MBP, маркеромолигодендроцитов, в то время как β5i колокализуется с CD3, маркером Т-лимфоцитов(Рис. 22Г).
Таким образом, β1i накапливается в резидентных клетках ЦНС, а β5i скореевсего привносится в ЦНС извне через поврежденный ГЭБ.Рисунок 22. Иммуногистохимический анализ срезов головного мозга неиммунизированных мышей линииSJL (А) и мышей линии SJL, развивающих EAE (Б,В,Г).Важно отметить, что в первичной культуре зрелых олигодендроцитов также наблюдалосьувеличение количества β1i при воздействии интерферона-гамма (Рис. 23).62Рисунок 23. Иммуноцитохимический анализ культуры зрелых олигодендроцитов, обработанных (IFNγ +) ине обработанных (IFNγ -) интерфероном-гамма. HST – ядерный краситель Hoechst 33342, O4 – антитело,специфичное к O4-маркеру олигодендроцитов, 20S – анти-α субъединицы протеасомы, b1i – анти-β1i.СравнениеспектровдеградацииMBPконститутивнойпротеасомойииммунопротеасомойИсходя из полученных данных, стало очевидным, что убиквитин-независимый протеолизМВР протеасомами из ЦНС здоровых мышей и мышей с ЕАЕ может приводить кразличным спектрам пептидных фрагментов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
