Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (1105762), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Готовилидвухкомпонентный гель следующего состава: концентрирующий гель – 5% смесиакриламид-бисакриламид (соотношение 29:1), 0.1% SDS, 0.125 M Трис –HCl, pH 6.8;разделяющий гель – 12-15% смеси акриламид-бисакриламид (соотношение 29:1), 0.1%SDS, 0.375 M Трис–HCl, pH 8.9. Для полимеризации сначала добавляли N,N,N',N'тетраметилэтилендиамин до концентрации 0,1%, а затем персульфат аммония до 0,1%.Образцы белковых препаратов смешивали с буфером нанесения в соотношении 1:1,прогревали 5 минут при 95С, наносили на гель и вели электрофорез при напряжении 90 Вдо перемещения красителя в разделяющий гель, после чего выставляли силу тока 20 мAна 1 пластину геля и вели электрофорез до момента выхода краски из разделяющего геля.По окончании электрофореза отделяли разделяющий гель, который затем окрашивалиКумасси синим R-250.82Окрашивание ПААГ Кумасси синим R-250 с усилением контраста солью медиРазделяющий гель 5 минут инкубировали в горячем растворе, содержащем 10%этанола и 10% уксусной кислоты.
Далее его помещали на 10 минут в горячий растворследующего состава: 15% этанола, 25% уксусной кислоты, 0.3 г/л красителя Кумассисиний R-250 и 0.45 г/л пятиводного сульфата меди. Затем гель многократно отмывали вгорячем растворе, содержащем 10% этилового спирта и 10% уксусной кислоты до полногоисчезновения фонового окрашивания.ИммуноблоттингПроводили гель-электрофорез белков в денатурирующих условиях по Лэммли сиспользованием предокрашенного маркера (Fermentas, Литва).
Отделяли разделяющийгель и проводили перенос на мембрану HyBond C extra (Amersham, США) на приборе дляполусухого электропереноса Bio-Rad Trans-blot Turbo (Bio-Rad, США) согласноинструкции производителя. Для этого вырезали мембрану, 3 листа бумаги Whatman 3MMразмером c гель и 3 листа ватмана на 1 см больше с каждого края, смачивали в все буфередля переноса.
Помещали на нижний электрод установки для переноса стопку бумагиWhatman 3MM (листы большего размера), сверху мембрану, затем гель, стопку бумагиWhatman 3MM, накрывали верхним электродом и вели электроперенос в течение 1часапри силе тока 0.8 мА/см2. По окончании процесса мембрану помещали в блокирующийраствор, содержащий 5% BSA в TBS или обезжиренного сухого молока в воде, накачающуюся платформу.
Инкубацию вели 1 час при комнатной температуре или 12-24часа при +4°C. Далее мембрану отмывали 3 раза по 5 минут в TBS, содержащем 0.05%Tween 20. Гибридизацию с первичными антителами проводили в течение часа вконъюгатном буфере, после чего опять трижды отмывали. Затем мембрану часинкубировалисовторичнымиантивидовымиантителами,конъюгированнымиспероксидазой хрена, в том же буфере и отмывали 5 раз по 5 минут. Проявление мембраныпроводили с помощью кита ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham, США).Денситометрический анализ результатов вестерн-блоттинга, а также электрофореза поЛэммли, проводили с помощью программы Quantity One.Электрофорез в неденатурирующих условияхАнализ состава препаратов протеасомы с помощью нативного электрофорезапроводили по методике, описанной в [179]. Состав форезного буфера совпадал с составомбуфера для гелей.
Использовали 4% разделяющий гель и 2,5% концентрирующий гель,соотношение акриламид:бис-акриламид составляло 37,5:1, для полимеризации к раствору83добавляли 0,1% N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин и 0,1% персульфата аммония. Вкаждую лунку наносили 2-4 мкг протеасомы в буфере для хранения. Электрофорез велипри 100-150 В при температуре +4ºC в течение 2 часов. После этого гели инкубировали в10 мл 100 мкМ раствора Suc-LLVY-AMC в буфере Г и визуализировали на приборе VersaDoc imaging system (Bio-Rad, США). Нативный электрофорез основного белка миелинапроводили при pH 4.5 в полиакриламидном геле на основе ацетатного буфера пометодике, описанной в [180] с последующим окрашиванием гелей Кумасси R-250.ИммунопреципитацияОбразцы 26S протеасомы (50 мкг/мл) обрабатывали PS-341 (15 мкМ) в течение 10минут, затем инкубировали с MBP (1 мг/мл) 30 минут при +4°С, затем в смесь добавлялиантитело анти-Rpn10 (H00005710-B01P, Abnova, Тайвань) или анти-MBP (ab7349, Abcam,Великобритания), инкубировали еще 45 минут при +4°С.
Затем добавляли смолу Protein ASepharose (Pharmacia Biotech, Швеция), перемешивали на шейкере 45 минут при +4°С,промывали PBS и элюировали преципитированные белки буфером глицин-HCl: (0.1 Мглицина, pH 3.0)Работа с эукариотическими клетками.Методы работы с эукариотическими клетками линии HEK и HeLaПоддержание в культуре эукариотических клеток линии HEK и HeLa.Клетки выращивали в среде DMEM, содержащей 10% бычьей фетальной сывороткии 2мМ L-глутамина, в инкубаторе при 37°С, 5% СO2 во флаконах (25 см2). Придостижении монослоя клетки рассевали. Отбирали культуральную среду, клеткипромывали 5 мл стерильного 1xPBS, потом добавляли 0.5 мл 0.25% раствора трипсина визотоническом буфере и инкубировали 3-5 минут при 37°С до открепления клеток.Открепившиеся клетки смывали и ресуспендировали в 4,5 мл среды DMEM с 10% бычьейфетальной сыворотки.
Затем клетки рассевали 1/5 по объему суспензии.Трансфицирование эукариотических клеток методом липофекции.Перед проведением трансфекции плазмидные ДНК дополнительно очищали отпримесей РНК и солей. Липофекцию проводили с использованием Lipofectamine™Reagentи Plus™Reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендации производителя. За день допроведения трансфекции высевали 2-6·104 клеток линии СНО в лунки 24-луночногопланшета в 500 мкл среды DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), содержащей 10%84фетальной сыворотки. Растворяли 0.4мкг ДНК в 25 мкл среды opti-MEM без сыворотки иантибиотиков, добавляли 0.4 мкл Plus™Reagent, перемешивали и инкубировали 10 минпри комнатной температуре. Добавляли 2 мкл Lipofectamine™Reagent в 25 мкл среды optiMEM без сыворотки и антибиотиков, перемешивали и инкубировали 10 мин прикомнатной температуре. Смешивали полученные растворы и добавляли по 50 мкл кклеткам.
Клетки выращивали в инкубаторе при 37˚С и 5% CO2. Анализировали через 2472 часа.ДлятрансфицированияклетокмалымиинтерферирующимиРНК(siRNA)использовали Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen, США) согласно рекомендациипроизводителя. Растворяли 10 пмоль siRNA в 25 мкл среды opti-MEM без сыворотки иантибиотиков. Также в 25 мкл среды opti-MEM без сыворотки и антибиотиков добавляли3мкл реагента Lipofectamine™ RNAiMAX, растворы смешивали друг с другом иинкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем полученные растворы добавлялик клеткам по 50мкл на 1 лунку 24-луночной плашки.При необходимости трансфицирования клеток и плазмидной ДНК, и siRNA в одномэксперименте сначала трансфицировали клетки siRNA, затем через 24 часа меняликультуральную среду на свежую, проводили трансфекцию плазмидной ДНК, и через 24часа после этого анализировали.Получение культуры зрелых олигодендроцитовКультуру зрелых олигодендроцитов получали из головного мозга мышат возрастом2-3 дня по методике, описанной в [181].
Мелко порезанные ткани головного мозгаобрабатывали последовательно трипсином и ДНКазой, отделяли отдельные клеткицентрифугированием и высевали на культуральные флаконы, покрытые поли-L-лизином икультивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки и 10 мкг/млгентамицина. Через 7 дней олигодендроциты отделяли от остальных клеток по принципуразличной силы адгезии,качая культуральные флаконы на орбитальной качалке соскоростью 200 оборотов/мин и амплитудой 2.5 см сначала 1 час, затем 16-20 часов.Полученные олигодендроциты высевали на 48-луночные культуральные планшеты,покрытые поли-орнитином с молекулярной массой 30-70 кДа и культивировали 14-20дней в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки, 10 мкг/мл гентамицина,0.1% BSA, 50 мкг/мл апотрансферрина, 5 мкг/мл инсулина, 30 нМ селенита натрия, 10 нМбиотина, 10 нМ гидрокортизона, 10 нг/мл цилиарного нейротрофического фактора (CNTF)и 15 нМ трийодтиронина (T3).85Получение активированных CD8+ Т-клеток.CD8+ T-клетки получали по методике, описанной в [88].
Мононуклеарные клеткибыли выделяли из периферической крови мыши путем центрифугирования над растворомфиколла Ficoll Paque Plus (GE Healthcare, Великобритания). CD8+ клетки изолировали спомощью набора для негативной селекции Dynabeads Untouched Mouse CD8 Cells negativeisolationkit(LifeTechnologies)всоответствиисинструкциейпроизводителяресуспендировали в культуральной среде advanced RPMI, содержащей 10% фетальнойсыворотки, 10 мкг/мл гентамицина и 10 нг/мл рекомбинантного интерлейкина-7 мыши, икультивировали совместно с дендритными клетками в соотношении 4:1 (T-лимфоциты кантигенпрезентирующим клеткам).
Дендритные клетки получали, обрабатывая селезенкимыши коллагеназой D c последующем разделением клеток по принципу различнойадгезии на пластике, по методике, описанной в [182]. Перед добавлением к CD8+ Тклеткам дендритные клетки обрабатывали пептидамиENPVVHFF (MBP83-90) илиFNFTAPFI (эпитоп вируса энцефаломиелита Тейлера, контрольный иррелевантныйпептид) (GeneCust, Luxembourg) в концентрации 10мкг/мл в течение 90 минут при 37°C.На третий день культивирования 50% культуральной среды заменяли на свежую идобавляли 50ME/мл рекомбинантного интерлейкина-2 мыши.На 7 день каждойпоследующей недели культивирования среду, содержащую суспензионные T-лимфоцитыотбирали, центрифугировали (350g, 8 минут), T-лимфоциты ресуспендировали в свежейкультуральной среде, содержащей интерлейкин-7, и добавляли к вновь выделеннымсвежим дендритным клеткам.
Через 3 дня после этого среду частично заменяли на свежуюс добавлением интерлейкина-2. Суммарное время культивирования составляло 4 недели.Определение цитотоксической активности CD8+ T-клеток.Способность CD8+ Т-лимфоцитов лизировать таргетные клетки определяли спомощью набора DELPHIA cytotoxicity assay kit (Perkin-Elmer) в соответствии синструкциями производителя. Олигодендроциты обрабатывали реагентом BATDA втечение 30 минут при 37°C, промывали PBS 5 раз и добавляли CD8+ Т-лимфоциты всоотношении 10:1 эффекторные:таргетные клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
