Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (1105762), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Через 2.5 часа культуральную средуотбирали и смешивали с раствором, содержащим соли европия Eu2+. О Флуоресценциюизмеряли методом TRF (time-resolved fluorescence) на приборе Varioskan Flash (Thermo,США) со следующими параметрами: длина волны возбуждения 340 нм, длина волныэмиссии 615 нм; задержка по времени 50 мкс, время интеграции 800 мкс, общее времяизмерения 5000 мс.86Иммуноцитохимическое окрашивание культур олигодендроцитовДля иммуноцитохимического окрашивания олигодендроциты культивировали накруглых покровных стеклах диаметром 12 мм, покрытых поли-L-лизином. Дляокрашиваниястекла сприкрепленнымиолигодендроцитамипромывалиPBSификсировали раствором 4% параформальдегида в PBS 20 минут при комнатнойтемпературе.
Пермеабилизовали 1 час при комнатной температуре в PBS содержащем 5%BSA и 0.2% Triton X-100. Блокировали 30 минут при комнатной температуре 50%лошадиной сывороткойв PBS. Окрашивание первичными антителами проводили вреакционном буфере на основе PBS, содержащем 1 мM CaCl2, 1% BSA, 0.1% Triton X-1001 ч при комнатной температуре или 16-20 ч при +4°С. Вторичными антивидовымиантителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями, окрашивали в том жебуфере 30-60 минут при комнатной температуре, затем добавляли 1мкг/мл красителяHoechst 33342 на 3 мин. Промывали PBS 5раз и фиксировали на предметных стеклах спомощью реагента ProLong Gold Antifade Reagent (Life Technologies, США).Индукция ЕАЕ у экспериментальных мышейЭксперименты проводили в медицинском центре им.
Асаф Арофе (Израиль) подруководством Д.Меламеда либо в питомнике лабораторных животных ФИБХ РАН подруководством Г.Б. Телегина с соблюдением всех регламентированных этических норм.ЕАЕ индуцировали в самках мышей линии SJL в возрасте от 6 до 8 недель с SPF (specifiedpathogen free) статусом в соответствии с протоколом [183] путем двукратного введения100 мкг гомогената спинного мозга мыши (ГСММ) в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ),содержащем туберкулин в концентрации 4 мг/мл.
Инъекции ГСММ на 1-й деньпроизводили подкожно в 2х точках, вдоль позвоночного столба, а на 3-й день в подошвызадних лап. Дополнительно в день инъекций ГСММ в ПАФ, мышам производиливнутривенные инъекции раствора Pertussis toxin (Calbiochem, США) в количестве 500нг/мышь.Тяжестьразвития аутоиммуннойпатологииопределялиежедневно всоответствии со следующей шкалой: 0 - норма, 1 – потеря тонуса хвоста, 2 – слабостьзадних ног или их паралич, 3 – сильный паралич конечностей, 4 – полный паралич(неспособность двигаться), 5 – смерть.ИммуногистохимияЭксперименты проводили в сотрудничестве с Ю.B. Люпиной и Я.Д Карповой влаборатории биохимии процессов онтогенеза под руководством Н.П.
Шаровой в87Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. Животных перфузировали черезсердце сначала 0,02 М PBS до вымывания крови из сосудов, а затем 4%-ным растворомпараформальдегида на 0,02 М PBS в течение 15 минут при 4°. Далее у животных выделялиголовной мозг и дофиксировали иммерсией (погружением в раствор) в том же фиксаторе2-4 часа при комнатной температуре.
Затем мозг помещали в 25%-ный раствор сахарозыдля криопротекции на при +4°С. После этого замораживали в изопентане (t= –45°C) ихранили при -20°С не более месяца. Криостатные срезы мозга толщиной 12 мкммонтировали на стекла, где и проводили двойное иммуногистохимическое окрашивание.12 мкм криостатные срезы последовательно инкубировали: 1. в 0,5% тритоне X-100 с 5%BSA на PBS в течении 40 мин при 20°С; 2.
в первичных антителах на PBS с 0,2%тритоном X-100 и 5% BSA в течение 18 часов при комнатной температуреОтмывали три раза по 5 минут и обрабатывали вторичными антителами в PBS втечение 2-х часов при 20°С. Затем срезы тщательно отмывали, заключали в Mowiol ианализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM RXA2 (Германия),конфокального микроскопа Leica TCS SP (Германия). Специфичность первых антителподтверждалась с помощью контролей, при которых реакция проводилась в отсутствиепервых антител. Возможность перекрестной реакции между первичными и вторичнымиантителами была исключена путем дополнительных контролей специфичности антител,при которых проводились инкубации каждого из первичных антител со вторичнымиантителами, выработанными к другому животному, то есть моноклональные антителамыши инкубировали со вторичными антителами против иммунноглобулинов кролика, инаоборот.
Отсутствие флуоресцентной метки свидетельствовало о специфичностиреакции.Получение очищенного препарата протеасомыЗа основу была взята методика выделения протеасомы, описанная в [184]. Головноймозг мышей промывали буфером А, нарезали на небольшие куски, гомогенизировали встеклянном гомогенизаторе в 3х объемах холодного (+4°С) буфера А и три разапроводили цикл замораживания-размораживания в жидком азоте. Центрифугировали отдебриса при 1500g, +4ºC, 30 минут, затем супернатант отделяли и центрифугировали при13200g, +4ºC, 30 минут. Полученный супернатант осаждали сульфатом аммония вконцентрации 40% от насыщения в течение одного часа при +4ºC для получения 26Sпротеасомы.
Центрифугировали при 13200g, +4ºC, 30 минут, осадок отделяли. Придобавлении к полученному супернатанту сульфата аммония до концентрации 70% отнасыщения в осадок выпадает фракция, содержащая 20S протеасому, которая в88дальнейшем может быть очищена по той же схеме, что и 26S. Осадок от высаливания 40%сульфатомаммонияресуспендироваливбуфереБ,полученныйрастворцентрифугировали 13200g, +4ºC, 10 минут для удаления нерастворившихся компонентов.Полученный таким образом раствор наносили на колонку Superose 6, уравновешеннуюбуфером Б, и вели элюцию буфером Б на скорости 0.3 мл/мин.
Собранные фракциианализировали на присутствие протеасомы, измеряяскорость гидролиза модельногопептидного субстрата Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA.Фракции, содержащие протеасому, помещали в мешок для диализа и проводилидиализ против буфера Е, содержащий 0.275 M NaCl. Полученный раствор наносили наколонку MonoQ, уравновешенную буфером E, содержащий 0.275 М NaCl, и промывали 10объемами этого буфера, затем проводили элюцию градиентом NaCl c 0.275 M до 1 M в 2025 объемах буфера E. Собранные фракции анализировали на присутствие протеасомы,измеряя скорость гидролиза модельного пептидного субстрата.
Фракции, содержащиепротеасому, переводили в буфер для хранения (буфер Г + 10% глицерина) методомдиализа при +4°C. Если активность выделенной протеасомы по модельному субстратубыла низкой, проводили концентрирование на микроколонках Microcon до концентрации40мкг/мл (около 16 нM).
Концентрацию определяли по методу Брэдфорда.Фракционирование протеасомы ультрацентрифугированиемГомогенат головного мозга мыши в буфере А центрифугировали от дебриса при1500g, +4ºC 30 минут, затем супернатант отделяли и центрифугировали при 16000g, +4ºC,30 минут. К супернатанту добавляли MBP и 1мкМ PS-341 и наносили 0.8 мл полученнойсмеси на центрифужный стакан с градиентом глицерина 10-55% в 24 мл в буфере 25 мMTris-HCl pH 7.5, 1 мM DTT, and 4 мM ATP.
Центрифугировали при 125000 g и +6°C 16часов. Отбирали фракции по 1 мл каждая и определяли в них присутствие протеасомы поактивности по флуорогенному субстрату Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC в присутствии 0,02%SDS (активация 20S протеасомы и ингибирование 26S протеасомы) и в отсутствии 0,02%SDS (активация 26S протеасомы и ингибирование 20S протеасомы)Выделение, ацетилирование и деиминирование MBPMBP выделяли из головного мозга коровы по методике, описанной в [185], методомхимической экстракции с последующей обращенно-фазовой хроматографией напрепаративной колонке C4 10/250 (Mashery-Nagel, Германия) на HPLC-хроматографеWaters 1525 (Millipore, США) в градиенте ацетонитрила 0-80% в 15 объемах колонки.
Во89всех растворах присутствовала 0.1% трифторуксусная кислота в качестве ион-парногоагента. Чистоту полученного препарата MBP определяли электрофорезом по Лэммли.Для некоторыхэкспериментовочищенныйМBPацетилировалиуксуснымангидридом в различных молярных соотношениях по методике, описанной в [186]. MBPэнзиматически деиминировали по методике, описанной в [102], инкубируя MBP cпептидиларгининдеиминазой (PAD) (Sigma Aldrich, США) при 52°С в буфере,содержащем HEPES, 5мМ CaCl2, 2мМ DTT, pH 7.6.
Реакцию останавливали кипячением втечение 5 минут. После ацетилирования или деиминирования MBP очищали нааналитической колонке C4 4.0/150 (Dr. Maisch GmbH, Германия) на HPLC-хроматографеWaters 1525 (Millipore, США) в градиенте ацетонитрила 0-40% в 15 объемах колонки. Вовсех растворах присутствовала 0.1% трифторуксусная кислота в качестве ион-парногоагента.Убиквитинилирование in vitroДля убиквитинилирования in vitro использовался набор Ubiquitin Conjugation kit(Enzo Life Sciences, CША) на основе S100-экстракта из клеток линии HeLa, илицитоплазматический S100-экстракт, полученный из клеток линии HeLa или головногомозга мышей линии BALB/c по методике [187]. Реакционная смесь (12.5 мкл) содержала20 мM Tris (pH 7.5), 1 мM DTT, 5мM MgCl2, S100-экстракт (60 мкг), убиквитин илиметилированный убиквитин (5.0 мкг), ATФ (1.0 мM), систему регенерации АТФ(фосфокреатин 10 мM и креатинфосфокиназа 4 ME/мл), в некоторых случаях добавлялиUbAl (0.5 мкг), MG132 (200 мкM), PS-341 (1.0 мкM), очищенную 26S протеасому (0.25мкг).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
