Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (1105762), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Смесь инкубировали при 37°С и реакцию останавливали добавлением буферананесения для электрофореза по Лэммли.Протеолиз белков in vitroГидролиз белков (1-3 мкг) протеасомой осуществляли в объеме реакции 12.5 мкл вреакционной смеси, содержащей 20 мМ Tris (pH 7.5), 1 мМ DTT, 5 мМ MgCl2, иочищенную 26S протеасому (0.25 мкг). Реакционную смесь инкубировали при 37°C,реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения образцов для электрофорезапо Лэммли. Образцы анализировали методом электрофореза по Лэммли c последующимокрашиванием красителем Кумасси R-250.Гидролиз MBP протеолитическими ферментами производили, инкубируя их с 2 мкгMBP в молярном соотношении фермент:субстрат = 1:100 в объеме реакции 20 мкл 3 часапри 37°C в реакционном буфере 50 мM Tris (pH 7.5), 5 мM CaCl2.
Олигопептиды отделяли90от компонентов с высокой молекулярной массой на микроколонках Microcon YM-10000(Merck Millipore, США) и направляли на масс-спектрометрию.Определение кинетических параметров ингибированияпротеасомыДля изучения ингибирования протеасомы из головного мозга мыши использовалисьследующие концентрации ингибиторов: PS-341 0.1-1000 нM, MG132 0.1-1000 нM, 1iспецифический пептидилэпоксикетон 2-100 мкM. Кинетические параметры обратимогоингибирования измеряли с использованием пептидного субстрата Suc-LLVY-MCA, пригидролизе образующего флуоресцентный продукт – 7-амино-4-метилкумарин. Измерениеинтенсивности флуоресценции вели при длине волны поглощения 360 нм, длине волныфлуоресценции 465 нм, температуре 37ºС на приборе Tecan Genios (Tecan, Швейцария).Препарат протеасомы смешивали с растворами ингибитора и субстрата в буфере Г,инкубировали 20 мин при 37°C, после чего измеряли интенсивность флуоресценциикаждые 30 секунд в течение 45 минут.
По увеличению флуоресценции определялискорость реакции гидролиза для всех комбинаций из 3 концентраций субстрата и 6концентраций ингибитора. Результаты измерений обрабатывали в программе Sigma Plot11.0смодулемEnzymeKinetics1.3.Кинетическиепараметрынеобратимогоингибирования 1i-специфическиv пептидилэпоксикетоном определяли с использованиемнабора для определения химотрипсин-подобной активности протеасомы Proteasome-Glo™Chymotrypsine-Like bioluminescent assay system (Promega, США) на спектрофлуориметреVarioskan Flash (Thermo Scientific) в черной 384-луночной плашке при 37°С.
Реагенты дляизмерения протеолитической активности протеасомы готовили в соответствии синструкцией производителя, финальная концентрация пептидного субстрата Suc-Leu-LeuVal-Tyr-aminoluciferin составляла 20 мкМ, концентрация протеасомы 0.1 нМ. Измерениелюминесценции начинали сразу же после добавления ингибитора. Значения kobs/[I] былиполученысиспользованиемпрограммыSigmaPlot11.0аппроксимациейэкспериментальных данных нелинейным методом наименьших квадратов к уравнению 1(1)Lt = Ls + (L0 - Ls)exp( - kobs t)где L0 - начальная интенсивность люминесценции, с течением времени приближающаяся кконечной интенсивности люминесценции Ls, с константой скорости kobs. Для определенияkobs/[I] реакцию проводили с 5 различными концентрациями ингибитора 3 раза с каждойконцентрацией.91Методы масс-спектрометрического анализаТандемный хромато-масс-спектрометрический анализЭксперименты проводили в сотрудничестве с А.С.Кононихиным в Центре массспектрометрии РАН под руководством профессора Е.Н.
Николаева. Тандемный хроматомасс-спектрометрический анализ (ESI-MS + жидкостная хроматография) осуществляли наприборе Agilent 1100 series (AgilentTechnologies, США) с хроматографической колонкойReprosil-PurBasicC18, (Dr.MaischHPLC, Германия).
После нанесения 2 мкл образцапроводили элюцию линейным градиентом ацетонитрила в воде в присутствии 0.1%муравьиной кислоты, с 3% до 50% в течение 45 минут, и затем 90% в течение 15минут.Элюент направлялся в масс-спектрометр 7-TeslaFinniganLTQ-FTUltra (ThermoElectron,Германия)ссамодельнымнаноэлектроспрейнымисточникомионизации.Масс-спектрометрический анализ фракций пептидов осуществлялся при помощи программыXcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) в 2-х стадийном режиме автоматическогоизмерения спектров (рис.
1). На первой стадии в масс-спектрометре измерялись точныемассы пептидов в диапазоне m/z 300-1600 с разрешением R=50000 для m/z 400 (числоионов в ячейке 5×106). На второй стадии из масс-спектра выбирались три максимальныхпика, для которых производилась столкновительно-индуцированная фрагментация (CID).Фрагментация CID и измерение спектров CID фрагментов происходили в линейнойквадрупольной ионной ловушке (число ионов 3×104). В режиме автоматического 2-хстадийного анализа пептиды, для которых фрагментация уже была проведена,динамическое исключались из рассмотрения на 30 секунд.Для количественного LC-MS/MS анализа с применением16O/18O, сразу послеионообменной хроматографии фракцию, содержащую 26S протеасому подвергалидиализу против буфера Г на основе H218O или H216O.
После диализа измеряли активностьпо субстрату Suc-LLVY-AMC и образцы протеасомы разводили до одинаковойактивности на единицу объема. Лиофилизованный MBP разводили в 20 мМ Tris-HCl pH7.5 на основе 18O- или16O-воды. Смесь 26S протеасомы (20 мкг/мл) и MBP (100 мкг/мл),инкубировали при 37C. Реакции останавливали, добавляя бортезомиб до концентрации 5мкМисразужезамораживая.Непосредственно18эквивалентные количества образцов на основе O- ивышеописаннойметодике.Интенсивности16пиков,перед92анализом,O смешивали и анализировали посоответствующихпептидам были скорректированы с учетом вклада немеченыхпо уравнению 2LC-MS/MS1618O-меченымO-содержащих пептидов(2)I0 = измеренная относительная интенсивность моноизотопного пика; I2 = измереннаяотносительная эффективность пика с массой + 2 Да; M0 = теоретическая относительнаяинтенсивность моноизотопного пика; M2 = теоретическая относительная интенсивностьмоноизотопных пиков с массой +2Да.
Для количественного анализа с использованиемизотопно-меченногопептидаОБМ83-90(PeptideProteinResearch,Великобритания),[ENPVVHFF*]меченыйпептид(F*=13C9H915NO)смешивалисMBP,гидролизованным различными типами протеасомы, в одинаковых соотношениях (5мклраствора пептида на 5 мкл образца).Каждый образец (10 мкл) содержал 2.5 нгENPVVHFF*. 2 мкл этого образца наносили на колонку с помощью автоматическогодозатора и подвергали LC-MS/MS анализу.
Количество природного пептида определялипо соотношению меченого и немеченого пептида на масс-спектре.Относительныеинтенсивности пиков определяли по масс-хроматограмме при помощи программыXcalibur (ThermoElectron, США).Масс-спектрометрический aнализ нативного белка (Top-down).Эксперименты проводили в сотрудничестве с А.С.Кононихиным в Центре массспектрометрии РАН под руководством профессора Е.Н. Николаева.
Для анализамодификаций нативного очищенного MBP использовали метод масс-спектрометриивысокого разрешения с электроспрейной ионизацией на приборе Bruker APEX UltraFTICR (BrukerDaltonics, США), который оснащен сверхпроводящим соленоидом 7-Теслаи источником ионизации ApolloII. Для создания электроспрея использовались следующиеусловия: скорость потока 2 мкл/мин; положительная мода; напряжение на входномэлетроде 3.5 kV; напряжение капилляра 4 кВ. Для внешней калибровки масс-спектрометраиспользовали стандартную смесь (Agilent, reorder № G2421A).Масс-спектрометрия с мониторингом множественных реакций.Эксперименты проводили в сотрудничестве с С.И.Ковальчуком в лабораториипротеомикиИБХ РАН, а также в лаборатории протеомного анализа НИИ физико-химической медицины под руководством профессора В.М. Говоруна.
Анализ проводилина масс-спектрометре QTRAP4500, оснащенном источником ионов NanoSpray III(ABSciex, Канада) и совмещенном с нано-поточной хроматографической системойnanoLC400 (Eksigent, США). ВЭЖХ система использовалась в конфигурации предколонка93– разделяющая колонка. Для хроматографического разделения использовались следующиебуферные растворы: буфер для загрузки образца на предколонку и буфер А - 98.9% H2O,1% метанол, 0.1% муравьиная кислота (v/v); буфер В - 99.9%ацетонитрил, 0.1%муравьиная кислота (v/v). Образцы наносили на предколонку Chrom XP C18 3 120 Å 350mm (Eksigent, США) при скорости потока 3 мкл/мин в течение 10 мин.
Разделениеосуществляли на колонке 3C18-CL-120 (3 мкм 120 Å) 75 мкм*150 мм (Eksigent, США)при скорости потока 300 нл/мин в линейном повышающемся градиенте буфера В от 5 до50% за 20 мин. Колонку и предколонку регенерировали после каждого анализа промывкой95% буфера В в течение 7 мин и уравновешивали 5% буфера В в течение 25 мин. Междуобразцами для исключения вероятности неполной отмывки предыдущего образца черезколонку и предколонку пропускали 5 коротких (5 мин) градиентов от 5 до 95% буфера В с3 мин промывкой 95% буфером В в конце.
Масс-спектрометр использовался в режимеанализа положительно-заряженных ионов. Фрагментация методом столкновительнойдиссоциации с использованием азота. Параметры МRМ анализа для анализируемогопептида были оптимизированы в процессе прямого ввода раствора пептида в источникионизации: родительский ион m/z 494.8 (z=+2), потенциал декластеризации 150В, времянакопления сигнала для каждого фрагмента 100 мс, m/z фрагментных ионов (энергиястолкновительной диссоциации, В): 745.5 (20), 648.4 (22), 549.3 (20), 450.2 (19), 433.2 (29),580.3 (26).Анализ и обработку результатов проводили в программе SkyLine(MacCossLab).Поверхностный плазмонный резонансИзмерения поверхностного плазмонного резонанса проводили на приборе BiacoreT200 optical biosensor (GE Healthcare) в Научно-образовательном центре нанотехнологийРАН Санкт-Петербургского академического университета с любезного разрешенияпервого проректора чл-корр. РАН М.В.Дубины.
Все процедуры выполнялись при 25°C сиспользованием стандартных чипов для иммобилизации CM5 sensor chips и фирменногобуфера HBS (pH 7.4, 0.01 М HEPES, 0.15 M NaCl, 0.05% сурфактанта P-20). Лигандыиммобилизовали на чипе (до достижения относительного сигнала иммобилизации 3500RU) с использованием NHS-EDC кита, следуя рекомендациям производителя. Аналитыдобавляли в различных концентрациях. Поверхность чипов регенирировали междуразличными аналитами промывкой 10 mM Глициновым буфером, pH 2.5.94ЗАКЛЮЧЕНИЕВ настоящей работе впервые описан факт убиквитин-независимой протеасомнойдеградациибелка,обладающегоярковыраженнымисвойствамиаутоантигена.Патофизиологическая значимость данного наблюдения состоит в том, что качественный иколичественный состав антигенных пептидов, образующихся при протеолизе MBP, восновном определяется составом каталитических субъединиц протеасомы. На основанииполученных в работе данных можно сделать предположение о роли убиквитиннезависимого гидролиза MBP иммунопротеасомой в развитии аутоиммунных патологийЦНС(Рис.35).РассеянныйсклерозиЕАЕхарактеризуютсяповреждениемгематоэнцефалического барьера и развитием воспаления в ЦНС, что приводит кактивному траффику аутореактивных лимфоцитов в ЦНС.
Секретируемые имипровоспалительные цитокины, в частности интерферон-гамма, взаимодействуют ссоответствующими рецепторами на поверхности олигодендроцитов и посредствомсигнальных каскадов активируют экспрессию в этих клетках иммуносубъединицыпротеасомы β1i. Поскольку иммунопротеасома отличается от конститутивной протеасомыпо протеолитической активности и субстратной специфичности, спектр пептидов,образующихсяпригидролизенеподконтрольногосистемеубиквитинилированияпротеасомного субстрата MBP, различен в норме и при развитии аутоиммуннойпатологии ЦНС.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
