Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (1105762), страница 13
Текст из файла (страница 13)
К нашему сожалению, отсутствуютточные литературные данные о том, какие именно аминокислотные остатки необходимыдля связывания H-2Ks. Известно только, что на H-2Ks могут успешно презентироватьсяпептиды FNFTAPFI, QTSYTSPTI и SNDDASVDFV [169]. Выравнивая аминокислотныепоследовательности этих пептидов (Рис. 29А), можно сделать предварительный вывод отом, что якорными сайтами для связывания с H-2Ks являются позиции P5/6-P8. Длясвязывания с MHC I аминокислотные остатки валина, серина и треонина являютсявзаимозаменяемыми [170], поэтому с большой вероятностью пептид ENPVVHFF будетсвязываться с H-2Ks.Рисунок 29. А. Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов, для которых показанапрезентация на MHC I гаплотипа H-2Ks и изучаемого в данной работе пептида ENPVVHFF. Б.
Анализсвязывания пептида ENPVVHFF с MHC I мыши методом МRМ масс-спектрометрии. Хроматограммы пополному ионному току (слева) и пик, соответствующий данному пептиду (время удерживания 18,3 мин) для5 МRМ транзиций (справа).Для экспериментального подтверждения данного предположения, нами быливыделены мононуклеарные клетки из периферической крови мышей линии SJL,интересующего нас гаплотипа H-2s, C3H (H-2k) – в качестве положительного контроля иBALB/c (H-2d) в качестве отрицательного контроля, т.к. якорные сайты для H-2d известны[171] и ENPVVHFF для связывания с H-2d по структуре очевидно не подходит.Мононуклеарные клетки инкубировали с синтетическим пептидом ENPVVHFF в течение5 часов, тщательно отмывали, лизировали и определяли содержание ENPVVHFF сметодом количественной масс-спектрометрии с мониторингом множественных реакций(MRM) (Рис.
29Б). В результате анализа исследуемый пептид был обнаружен в образцах70клеток с гаплотипами H-2k и H-2s , но не обнаружен в клетках с гаплотипом H-2d.Методом MRM также было показано, что количество ENPVVHFF, образованного изэндогенного МВР,увеличивается в культуре олигодендроцитов приобработкеинтерфероном-гамма, но в данном случае применяемая методика не позволяет отличитьпептид, находящийся в цитоплазме, от пептида, презентированного на MHC I.На следующем этапе работы из мышей линии SJL методом активации ex vivo былиполучены цитотоксические T-лимфоциты, специфичные к ENPVVHFF. В качествеконтроля использовались цитотоксические T-лимфоциты, специфичные к пептиду вирусаэнцефалита Тэйлера FNFTAPFI. Цитотоксические ENPVVHFF-реактивные T-лимфоцитыспецифически лизировали олигодендроциты, полученные из мышей линии SJL, при этомэтот процесс ингибировался анти-MHC I антителами и его эффективность значительноувеличивалась в случае олигодендроцитов, обработанных интерфероном-гамма (Рис.
30).Рисунок 30. Лизис олигодендроцитов, обработанных (IFNγ +) и не обраотанных (IFNγ -) интерферономгамма, цитотоксическими T-лимфоцитами, специфичными к пептиду MBP83-90 [ENPVVHFF] иконтрольному пептиду [FNFTAPFI].На основании полученных данных можно сделать вывод, что при развитии EAEменяется состав каталитических субъединиц протеасомы, находящейся в ЦНС, чтоприводит к изменению ее субстратной специфичности и паттернов деградации MBP.Замещение β1 на β1i приводит к увеличению химотрипсин-подобной активности [172] и71снижению каспазоподобной активности [173].
Благодаря увеличению химотрипсинподобной активности протеасомы образуются пептиды с гидрофобным C-концом,наличие которого предпочтительно для связывания с MHC I [174], в то время как каспазоподобная активность может приводить к разрушению некоторых Т-клеточных эпитопов[28].Волигодендроцитахприсутствуетдостаточнобольшоеколичествоиммуносубъединицы β1i, что создает условия для процессинга и презентацииаутоантигенов, приводящей к активации специфичных к нейроантигенам T-клеток идальнейшему прогрессу аутоиммунной патологии. Недавние исследования показали, чтоналичие определенной мутации в гене, кодирующем β1i субъединицу иммунопротеасомы,влияет на процессинг MBP, а также снижает риск развития рассеянного склероза [112].Этот факт, наряду с полученными в данной работе результатами, также свидетельствует опатогенной роли β1i субъединицы иммунопротеасомы в развитии аутоиммунныхпатологий ЦНС.Подходы к направленному подавлению гидролиза МВРпротеасомой для терапии ЕАЕКакпоказалирезультатыпредыдущихэкспериментов,протеолизMBPиммунопротеасомой может быть одним из этапов CTL-опосредованного разрушениямиелиновой оболочки нервных волокон и развития аутоиммунных патологий ЦНС.
Еслиблокировать этот процесс, то это, возможно, остановит или замедлит аутоиммуннуюдемиелинизацию. Поэтому следующим этапом работы был анализ различных способовблокирования процесса протеолиза MBP протеасомой в качестве потенциальнойвозможности терапии аутоиммунных патологий ЦНС. Продемонстрированное вышезамедление гидролиза MBP протеасомой при снижении положительного заряда белкасложно реализуемо in vivo, т.к.
известно, что уменьшение его положительного зарядаприведет к изменению структуры мембраны олигодендроцитов [175] что являетсягубительным для миелиновых оболочек нервных волокон. Поскольку протеасомаучаствует во множестве процессов, включая удаление отслуживших и дефектных белков ирегуляцию клеточного цикла, неспецифическое блокирование активности протеасомыявляется нежелательным.
Гораздо более перспективным в качестве терапевтическоймишени при ЕАЕ видится специфическое блокирование иммунопротеасомы.Использование малых интерферирующих РНКПодавлениеэкспрессиииммуносубъединицпротеасомыспомощьюсоответствующих siRNA является способом воздействия на процесс протеолиза MBPиммунопротеасомой. Для оценки эффективности данного подхода в клетки линии HeLa,72предварительно обработанные интерфероном-гамма, были трансфицированы siRNA ксубъединицам иммунопротеасомы β1i и β5i, либо некодирующая siRNA в качествеконтроля, а затем была трансфицирована генетическая конструкция, кодирующая MBP(Рис. 31). Проведение предварительной трансфекции клеточной культуры siRNA киммуносубъединицам протеасомы β1i и β5i в сравнении с контрольной siRNA не толькопонижало уровень экспресии соответствующих иммуносубъединиц, но и ингибироваловнутриклеточный протеолиз МВР.
К сожалению, ингибирование протеолиза MBP путемвведения малых интерферирующих РНК к иммуносубъединицам протеасомы было явнонедостаточно эффективным для применения в качестве метода терапии EAE in vivo.Рисунок 31. А. Иммуноцитохимический анализ клеток линии HeLa, трансфицированных генетическойконструкцией, кодирующей MBP, слитный с Flag эпитопом. Контрольная трансфекция – HA-c-Myc. Б.Вестерн_блоттинг лизатов клеток линии HeLa, экспрессирующих рекомбинантный MBP, обработанных(IFNγ+) и необработанных (IFNγ–) интерфероном γ, а также клеток, в которых понижен уровеньиммуносубъединиц b1i и b5i в результате воздействия малых интерферирующих РНК.Использование ингибиторов протеасомыДругой подход к блокированию протеолитической активности иммунопротеасомызаключаетсявприменениипроанализированыкаталитические3низкомолекулярныхингибиторасубъединицыпротеасомы:конститутивнойингибиторов.PS-341,иДляэтоговоздействующийиммунопротеасомы;набыливсеMG-132,ингибирующий преимущественно химотрипсин-подобную активность конститутивной ииммунопротеасомы, и β1i-специфический пептидилэпоксикетон, необратимо ковалентносвязывающий остаток треонина в активном центре данной субъединицы.
Чтобыопределить количественные параметры ингибирования, было проанализировано влияние73этих ингибиторов на активость протеасомы по флуорогенному субстрату Suc-Leu-LeuVal-Tyr-AMC (Рис. 32). Параметры ингибирования для PS-341 и MG-132 (Табл. 3)соответствовали ранее опубликованным данным [176, 177]. Константа ассоциации kobs/[I]для β5i-специфического пептидилэпоксикетона составила около 240 M-1сек-1. PS-341 иMG-132 одинаково воздействовали на протеасому из головного мозга здоровых иразвивающих ЕАЕ мышей.
В случае β1i-специфического пептидилэпоксикетона, как иследовало ожидать, эффективность ингибирования напрямую зависела от количестваконститутивных и иммуносубъединиц протеасомы. Наиболее эффективно данныйингибитор подавлял активность протеасомы из головного мозга EAE-SJL мышей, приэтом он практически не воздействовал на протеасому из головного мозга мышей линииBALB/c (Рис.
33А). Все три протестированных ингибитора существенно замедлялигидролиз MBP 26S протеасомой in vitro (Рис. 33Б).Таблица 3. Ингибирование химотрипсин-подобной активности протеасомы из головного мозга мышей.26S протеасома изголовного мозгаPS-341* Ki, нМMG-132† Ki, нМβ1i-PEkkobs/[I], M-1с-1BALB/c7±228±8не определенаКонтрольные SJL10±335±8230±60EAE SJL6±226±4250±4074Рисунок 32. Определение констант ингибирования для PS-341 (A), MG-132 (Б) и β1i-специфическогопептидилэпоксикетона (В) на основании экспериментальных данных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
