Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (1105762), страница 9
Текст из файла (страница 9)
В качествецитотоксическогодоменаприменяюткаталитическийдоменрастительныхилибактериальных токсинов. Адресная доставка терапевтических агентов имеет два основныхпреимущества по сравнению с неспецифической терапией: направленная терапияпозволяет применять лекарства в меньших концентрациях, что уменьшает общеенеспецифическое цитотоксическое воздействие препарата на организм; цитотоксическоевоздействие препарата сказывается в основном на клетках-мишенях.2) Антиген-специфическая терапия, которая направлена на аутоиммунные Т- и Вклетки, специфичные к определенной антигенной детерминанте. Примером такого43подхода является широко использующаяся в настоящее время терапия глатирамерацетатом.
Недавно группа исследователей показала, что модифицированные вариантыCopaxon – сополимеры FYAK и VWAK еще более эффективно супрессируют EAE намодельных животных [133]. Авторы объясняют это лучшим связыванием данныхполимеров с молекулами MHC II. Перспективным направлением является введение такназываемых “измененных пептидных лигандов” (ИПЛ), взаимодействующих с Тклеточнымирецепторами.Принципработыданногометода,основанногонаиммунодоминантных пептидах, заключается в индукции иммунотолерантности привведениибольшоймутированнымидозыантигена.или[135]ИПЛукороченнымиявляются[136]модифицированнымиучастками[134],последовательностей,связывающихся с Т-клеточными рецепторами. ИПЛ могут частично активировать Тклетки, переключая их с фенотипа Th1 на Th2, а также, в некоторых случаях,индуцировать переход Т-клетки в анергию.3) Регенеративный подход к терапии, который заключается в применениибензтропина.
Бензтропин (Cogentin) в настоящее время применяется в терапии болезниПаркинсона и является антагонистом мускариновых рецепторов M1 и M3. Недавно былопоказано, что бензтропин вызывает дифференциацию олигодендроцитов, повышениеуровня экспрессии MBP и миелинизацию аксонов in vitro и снижает тяжесть протеканияэкспериментальной модели ремитирующего РС у мышей [137].4)Использованиенеспецифическогоантиоксидантов,повреждениянервнойблокирующихткани.одинПотенциальноизмеханизмоввозможнокакстимулировать собственную антиоксидантную систему, так и внести извне препараты,обладающие антиоксидантной активностью [138]5)Использование ингибиторовпротеасомы.Какужеупоминалосьранее,иммунопротеасома постоянно экспрессируется в клетках иммунной системы, а ееингибирование или нокаут приводят к подавлению подавлению дифференциации Tклеток, снижению продукции цитокинов и хемокинов и другим иммуносупрессорнымэффектам.Поэтомукакспецифическиеингибиторыиммунопротеасомы,такинеспецифические ингибиторы всех каталитических субъединиц представляют большойинтерес как потенциальные терапевтические агенты против аутоиммунных заболеваний, вчастности против рассеянного склероза.
Показано, что ингибитор PR-957, специфическийк β5i каталитической субъединице иммунопротеасомы, снижает тяжесть течениязаболевания и предотвращает возникновение обострений в экспериментальной моделиремитирующего PC у мышей [139]. Положительные результаты в терапии ЕАЕ также44давали ингибиторы протеасомы, воздействующие одновременно на конститутивные ииммуносубъединицы: PS-341 [114], PS-519 [140] и ритонавир [141].45РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕИсследование роли модификации МВР убиквитином в процесседеградации протеосомойВнутриклеточная деградация MBP протеасомой в клетках млекопитающихНа настоящий момент известно, что один из основных нейроантигенов, MBP и егопептидные фрагменты могут индуцировать аутоимунную нейродегенерацию (ЕАЕ) и вэтом смысле они обладают энцефалитогенными свойствами и участвуют в формированииаутоиммунного ответа [142, 143], Показаночто МВР подвергаетсякаталитическойдеградации различными ферментами и каталитическими антителами [94, 144], Недавноустановлено, что комбинация структурных фрагментов МВР может быть использована вкачестве лекарственного средства при терапии РС [145, 146].
В связи с этим большойинтерес представляет изучение метаболизма внутриклеточного MBP в норме и патологии.В эукариотической клетке существует две основных системы деградации, – лизосомная ипротеасомная. Подавляющее большинство внутриклеточных белков гидролизуется 26Sпротеасомой по убиквитин-зависимому пути. Убиквитин-протеасомная система вовлеченав патогенез многих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера иПаркинсона, амиотропный латеральный склероз, прионовые болезни и ряд других [147].Первымэтапомнашегоисследованиябыловыяснениеролиполиубиквитинилирования в процессе внутриклеточного гидролиза MBP.
ДеградациюMBP изучали с использованием клеток HEK, трансфицированных генетическойконструкцией, кодирующей слитный белок, состоящий из рекомбинантного MBPчеловека и FLAG-эпитопа. В качестве контроля использовали зеленый флуоресцентныйбелок (GFP), который, как известно из литературы [148], не подвергается гидролизупротеасомой (Рис.12А). МВР иммунопреципитировали из лизатов клеток, обработанных инеобработанныхвысокоспецифичнымингибитором протеасомыPS-314, идалееанализировали методом вестерн-блоттинга. В обоих случаях в образцах отсутствоваликакие-либо значимые количества убиквитинилированных форм MBP (Рис.12Б), несмотряна очевидное накопление полиубиквитиновых конъюгатов клеточных белков приингибировании протеасомы. Чтобы определить время полужизни внутриклеточного MBP,клеточные культуры обрабатывали циклогексимидом – реагентом, блокирующимрибосомальный синтез белка, в этом случае процесс синтеза белка не интерферирует с егопротеолизом.
Вестерн-блоттинг лизатов клеток, обработанных циклогексимидом втечение различных временных промежутков (Рис. 12В), показал, что в клетках HEK MBP46достаточно быстро подвергается протеолизу со средним временем полужизни около 1часа. При этом протеолиз МВР очевидно осуществляется протеасомой, т.к. в присутствииPS-341 его деградация практически полностью останавливается. Количество GFP, неявляющегося субстратом для протеасомы, с течением времени остается практическинеизменным.Рисунок 12. А. Клетки HEK, трансфицированные и не трансфицированные генетическими конструкциями,кодирующими рекомбинантный MBP человека (rhMBP) или GFP и вестерн-блоттинг (ВБ) их лизатов. Вкачестве контроля процедуры нанесения применяли гибридизацию этой же мембраны с моноклональнымиантителами к β-актину (актин) Б.
Клетки HEK трансфицировали генетической конструкцией, кодирующейMBP, через 24 обработали PS-341 или ДМСО, лизировали и провели иммунопреципитацию (ИП) сиспользованием антитела к FLAG-эпитопу. Вестерн-блоттинг элюатов (слева), гибридизация с анти-FLAGантителом. Вестерн-блоттинг исходных лизатов (справа), гибридизация с антителом к полиубиквитиновымконъюгатам. B. Определение скорости протеолиза белков в клетке с использованием циклогексимида(СHX).Для анализа протеолиза внутриклеточного MBP протеасомой в условиях, болееприближенных к физиологическим, были проведены аналогичные эксперименты вкультуре зрелых олигодендроцитов мыши.
Для этого нами была получена первичнаянейральная культура, обогащенная олигодендроцитами. Иммуноцитохимический анализподтвердил наличие значительного количество OSP-позитивных клеток (oligodendrocytespecific protein, олигодендроцит-специфический белок), при этом процентное содержание47GFAP-позитивных клеток (glial fibrillary acidic protein, маркер астроцитов) не превышало10% (Рис. 13А). Для усиления экспрессии эндогенного MBP клетки обрабатывали 0.2 mMраствором бензотропина в течение двух суток перед анализом [137].
Важно отметить, чтовнутриклеточный MBP заметно накапливался под действием ингибитора протеасомы PS341 (Рис. 13Б), что свидетельствует о протеасомной природе метаболизма МВР волигодендроцитах.Рисунок 13. Протеолиз MBP в культуре олигодендроцитов. А. Иммуноцитохимическое окрашиваниекультуры зрелых олигодендроцитов. HST – ядерный краситель Hoechst 33342, OSP – анти-OSP антитело,GFAP – анти-GFAP антитело Б.
Вестерн-блоттинг лизатов культуры зрелых олигодендроцитов,обработанных и необработанных PS-341 и бензтропином. Гибридизация с антителами, специфичными кMBP и актину.В подавляющем большинстве случаев модификация белка остатками убиквитинаявляется необходимым и достаточным сигналом для его протеосомной деградации. Длятого чтобы подвергнуться гидролизу протеасомой, белок в абсолютном большинствеслучаев должен быть убиквитинилирован [31]. Чтобы определить, подвергается ли MBPубиквитинилированию в клетках, рекомбинантный MBP-FLAG иммунопреципитировалииз гомогената клеток HEK, котрансфицированных генетическими конструкциями,кодирующими rhMBP-FLAG и убиквитин, слитный с HA-эпитопом (HA-Ub) (Рис. 14).НА-Ubнарядусубиквитиномдикоготипавключаетсявформирующиесяполиубиквитиновые цепи и может быть детектирован методом вестерн-блоттинга.
Вкачестве положительного контроля использовали прекурсор NF-κB белок p105, слитный сFLAG-эпитопом, который, как известно, подвергается гидролизу протеасомой поубиквитин-зависимому пути [40].В качестве отрицательного контроля использовали48белок Ubc6. После обработки клеток ингибитором протеасомы MG132 в преципитатах,содержащих MBP-FLAG, отсутствовали даже следовые количества полиубиквитиновыхконъюгатов, в то время как в преципитатах, содержащих p105-FLAG, полиубиквитиновыеконъюгаты явно присутствовали. Таким образом, можно предположить, что в клеткахмлекопитающих MBP подвергается гидролизу протеасомой вероятнее всего в отсутствииполиубиквитинилирования.Рисунок 14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
