Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (1105762), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Это подтверждается многочисленными экспериментами:прирасщеплениибелковиммунопротеасомойобразуетсязначительнобольшееколичество пептидов, С-конец которых соответствует иммуногенным фрагментам, чемпри расщеплении тех же белков стандартной протеасомой [19, 23]. У мышей, нокаутныхпо β1i, наблюдается существенное изменение репертуара цитотоксических T-лимфоцитов,распознающих антигенные пептиды в комплексе с MHC I [24]. У мышей, нокаутных поβ5i, в отличие от нокаутных по β1i или β2i, на 50% уменьшается количество молекул MHCI [25], и они более подвержены развитию инфекционных заболеваний [26].В работе [27] было показано, что существуют антигенные пептиды, которые намноголучше производятся стандартной протеасомой, чем иммунопротеасомой. Некоторыеантигенные пептиды содержат в своей последовательности гидрофобные остатки, ипоэтому они разрушаются иммунопротеасомой, которая имеет высокую активность потипу химотрипсина и расщепляет такие пептиды после гидрофобных остатков.
При этомтакие пептиды достаточно эффективно производятся стандартной протеасомой и16представляются на поверхности клеток в комплексе с молекулами MHC I. И наоборот,антигенные пептиды, содержащие кислые аминокислотные остатки, разрушаютсястандартной протеасомой, которая расщепляет их после кислого остатка, но эффективнопроизводятся иммунопротеасомой [28].Недавно был обнаружен новый тип протеасомы, названный тимопротеасома [29].Она содержит субъединицу особого типа, по структуре наиболее близкую к β5 и β5i. Этасубъединица названа β5t, она экспрессируется только в эпителиальных клетках корытимуса, где она встраивается в протеасому вместо β5 или β5i. Другие две каталитическиесубъединицы тимопротеасомы являются иммуносубъединицами.
У тимопротеасомыпрактически отсутствует химотрипсин-подобная активность. Поэтому на молекулах MHCэпителиальных клеток коры тимуса презентируется уникальный набор пептидов, чтоимеет большое значение для положительной селекции Т-клеток, происходящей в тимусе[30].Система убиквитинилирования. Убиквитин-зависимый и убиквитин-независимыйпротеолизОколо половины всех клеточных белков подвергается гидролизу протеасомой.Однако, прежде чем начнется этот процесс, она должна распознать объект протеолиза покакому-то признаку. Маркировкой клеточных белков занимается специальная системаферментов – система убиквитинилирования. Деградация белков по убиквитин-зависимомупутивключаетдве последовательные стадии:1) маркировка субстрата путемковалентного связывания цепи из молекул убиквитина 2) деградация маркированныхбелков 26S протеасомой и высвобождение убиквитина, пригодного для дальнейшегоиспользования [31].Система убиквитинилирования, включающая три типа ферментов (Е1, Е2 и Е3),высокоспецифична и избирательна за счет построения по принципу иерархическогоусложнения (Рис.
5). Фермент E1 (может быть двух типов, Ube1 или Ube1-L2)присоединяет убиквитин, активируя его. Затем активированный убиквитин переноситсяна убиквитин-конъюгирующий белок Е2 (ubiquitin-conjugating enzymes, UBCs). В геномемлекопитающих закодировано около 30 различных ферментов Е2. После этого убиквитинпереноситсянацелевойбелоксучастиемубиквитин-лигазыЕ3.Вклеткахмлекопитающих содержится более 600 белков и мультимерных комплексов, обладающихактивностью Е3. Убиквитин может связываться с белком-субстратом или через его Nконец, или изопептидной связью через аминогруппу остатка лизина. Иногда убиквитинможет связываться с белками также через остатки цистеина, серина или треонина.17Убиквитин связывается с белками или в виде мономера, или в виде полиубиквитиновойцепи, которая формируется через внутренние остатки лизина.
В молекуле убиквитинасодержится 7 остатков лизина, наиболее типично формирование полиубиквитиновой цепичерез образование изопептидной связи между остатком лизина-48 и C-концевым остаткомглицина-76,хотяпротеасомаспособнараспознаватьидругиевариантыполиубиквитиновых цепей. Недавно был обнаружен еще один фермент системыубиквитинилирования, Е4, который участвует в элонгации коротких полиубиквитиновыхцепей, но полиубиквитинилирование большинства белковых субстратов может протекатьи без его участия [32]. Кроме маркирования белков, которые должны быть разрушены,убиквитинилирование может также служить другим целям, таким как регуляцияактивности ферментов или факторов транскрипции. Полиубиквитиновая цепь связываетсяс субъединицами протеасомы Rpn10 или Rpn13 [33].
Убиквитин удаляется с белковдеубиквитинилирующими ферментами – убиквитин-изопептидазами и может бытьиспользован для следующего цикла убиквитинилирования [34]. Известны случаи, когдаубиквитин протеолизуется вместе с субстратом [35].Рисунок 5. Схема процесса убиквитин-зависимой деградации белков протеасомой. Адаптировано из [36]Длягидролизасубстратапротеасомой,необходимо,во-первых,наличиедетерминанты, обуславливающей связывание 19S субчастицей протеасомы, и, во-вторых,18наличие в белке неструктурированной области, с которой начинается расплетаниеполипептидной цепи и транслокация ее в каталитическую полость протеасомы [37]. Донедавнего времени считалось, что для распознавания субстрата протеасомой он долженбыть промаркирован цепью из как минимум четырех молекул убиквитина [38], аобнаруживаемыепротеолитическихвклеткемоноубиквитинилируемыепроцессах,такихкакбелкимембранныйучаствуюттранспортивне-регуляциятранскрипции.
Но в последнее время стали появляться исследования, демонстрирующие,чтодлягидролизапротеасомойвнекоторыхслучаяхдостаточномоноубиквиинилирования или множественного моноубиквитинилирования несколькихсайтов одной белковой молекулы. Например, PAX3, регулятор дифференциациимышечныхклеток,протеолизуетсяпослемоноубиквитинилированияодногоопределенного остатка лизина [39]. Моноубиквитинилирование цитоплазматическогодомена белка SDC4, рецептора клеточной адгезии, также приводит к деградации этогобелка протеасомой. Для расщепления протеасомой p105, предшественника факторатранскрипцииNF-κB,доактивногофакторатранскрипции,p50,необходимомоноубиквитинилирование нескольких остатков лизина в составе этой молекулы [40].Множественное моноубиквитинилирование приводит к протеолизу также в случаефосфолипазы D (PLD) и циклина B1. Путем экспериментов как на природных белках, таки на полипептидах с искусственно созданными аминокислотными последовательностями,показано, что в общем случае для деградации полипептидных цепей длиной от 20 до 150аминокислот достаточно моноубиквитинилирования, а белки размером больше 150аминокислот,какправило,гидролизуютсяпротеасомойприконъюгациисполиубиквитиновой цепью [41].Тем не менее, существуют белки, для гидролиза которых протеасомой не нужно нимоно-, ни полиубиквитинилирование.
Одним из наиболее изученных убиквитиннезависимых субстратов 26S протеасомы является орнитиндекарбоксилаза (ODC). 37 Сконцевых аминокислотных остатков этого фермента обуславливают его ассоциацию спротеасомой, а также содержат структурно неупорядоченную область, с которойначинается транслокация полипептидной цепи в каталитическую полость протеасомы.При удалении С-концевого домена ODC перестает гидролизоваться протеасомой.
Инаоборот, если создать химерный белок, состоящий из 37 С-концевых аминокислотныхостатков ODC и какого-либо белка, не являющегося убиквитин-независимым субстратом,например GFP, то такой белок будет протеолизоваться убиквитин-независимо [42].Протеолиз ODC существенно ускоряется при связывании со вспомогательным белком –антизимом-1, при связывании с которым C-конец ODC становится более стерически19доступным.
При этом антизим не протеолизуется вместе с ODC. Убиквитин-подобныйбелок FAT10 также может гидролизоваться протеасомой убиквитин-независимо благодаряегоспособностивзаимодействоватьсVWA-доменомубиквитин-связывающейсубъединицы протеасомы Rpn10.Многие структурно неупорядоченные белки или белки, имеющие достаточнокрупные неупорядоченные сегменты, могут гидролизоваться 20S протеасомой безубиквитинилирования.Примерами таких белков могут служить α-синуклеин, IκBα,факторы супрессии опухолей p53 и p73, ингибитор циклин-зависимой киназы p21.Протеолиз некоторых из этих белков, например факторов супрессии опухолей p53 и p73α,регулируется NADH-зависимым ферментом NQO1, который связывается с даннымибелками и защищает их от действия 20S протеасомы [43].
Протеолиз других подобныхсубстратов блокируется так называемыми nanny proteins – белками, специфическисвязывающими структурно неупорядоченные области вновь синтезируемых белков. Вслучае p53 роль nanny protein выполняет белок Hdmx, в случае IκBα – NFκB. Еще одинпример – активатор транскрипции AP1, который является гетеродимером, состоящим избелков cFos и cJun. сFos имеет несколько структурно неупорядоченных областей, и всвободном виде подвергается гидролизу 20S протеасомой [44].Ингибиторы протеасомыПептидазная активность протеасомы по одному или сразу нескольким типам можетбыть заблокирована низкомолекулярными ингибиторами. Большинство известныхингибиторов направлены на химотрипсин-подобную активность, но существуютселективные ингибиторы трипсино- и каспазоподобной активности.Существует несколько различных классов ингибиторов протеасомы.1) Альдегидные производные пептидов – конкурентные обратимые ингибиторы.
Такиесоединения легко синтезировать и они эффективно проникают в клетку, однако они неочень специфичны и помимо протеасомы ингибируют также некоторые протеазы,напримеркальпаининекоторыекатепсины.Наиболеечастоприменяемымиингибиторами этой группы являются MG-132 (Z-LLL-CHO) и PSI (Cbz-Ile-Glu(O-tBu)-AlaLeu-CHO). MG-132 в концентрациях 50-100 мкМ ингибирует все три типа активностипротеасомы, а в концентрациях на два порядка ниже – ингибирует только химотрипсинподобную активность, не воздействуя при этом на другие типы активности.20Изменяя аминокислотный состав пептида, можно получить селективные ингибиторыкаспазоподобной активности, например содержащие аспарагиновую кислоту в Р1-позицииAc-Ala-Pro-Nle-Asp-al, Z- Pro-Nle-Asp-al [45].2) Винилсульфоновые производные пептидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
