Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Для каждого полимера приведены усредненныеданные трех экспериментов. Процесс мицеллообразования полимеров был исследован в томже диапазоне концентраций в отдельном эксперименте и показан на рисунках как увеличениеинтенсивности флюоресценции ДФГТ (▲, правая ось ординат). Значения ЭКМЛУ, ККМ и ННКуказаны стрелками в порядке перечисленияПри дальнейшем увеличении концентрации плюроника от 13 мкМ до 250 мкМколичество выживших клеток оставалось более или менее постоянным, образуя плато. Этотрезультат позволяет заключить, что 13 мкМ - это ЭКМЛУ - минимальная концентрацияплюроника Р85, достаточная для максимально возможного подавления устойчивости раковыхклеток MCF7/R.91На том же графике приведены результаты определения ККМ плюроника Р85 (▲, праваяось ординат).
Диапазон концентраций 3 - 13 мкМ плюроника Р85 меньше ККМ = 90 ± 30 мкМ.Следовательно, способностью подавлять МЛУ обладают юнимеры Р85. Снижение количестваклеток при концентрации плюроника более 300 мкМ обусловлено цитотоксичностью самогополимера (ННК = 550 ± 150 мкМ).Те же закономерности оказались справедливы и для полимера с иной природой имолекулярной стркутурой гидрофильного блока – разветвленного полиглицерина PG2 (рис.
29Б). Снижение количества клеток наблюдалось уже при 0,6 мкМ юнимеров PG2, а при 2 мкМPG2 оно снижалось до 44% - минимума при 5 мкг/мл DOX.Таким образом, предложенная постановка опытов позволяла определять ЭКМЛУ.Поэтому она была использована для анализа всех остальных полимеров (табл. 8). Оказалось,что наименьшее количество клеток, которое могло быть достигнуто в присутствии полимера и5 мкг/мл DOX, было примерно одинаковым для всех исследованных соединений и составило40-60%. Этот результат подтверждает, что определенные нами концентрации ЭКМЛУполимеров вызывали максимально возможное подавление МЛУ.Сопоставление значений ЭКМЛУ и ККМ каждого полимера показало, что всесополимеры, гидрофильный блок которых составлял 10 - 50% от общей массымакромолекулы, подавляли МЛУ в виде юнимеров.
Таким образом, полученные намирезультаты полностью подтвердили открытие Батраковой с соавт. о подавлении МЛУотдельными молекулами плюроников [24]. Более того, исследование широкого круга блоксополимеров, различающихся по структуре гидрофильного и гидрофобного блоков, позволилопоказать, что это свойство присуще также сополимеру на основе полидиметилсилоксана,полиглицеринам P(G2)2, PG2, PG30 и Brij-35 (табл.
8).При оценке эффективности действия фармакологических препаратов большоевнимание уделяется такому параметру, как терапевтический индекс, который показывает, насколько различаются предельно допустимая концентрация соединения (в нашем случае ННК)и концентрация, достаточная для получения терапевтического эффекта (в нашем случаеЭКМЛУ). Если эти значения близки, то велик риск передозировки.92Таблица 8. Минимальная концентрация полимеров, достаточная для подавления МЛУ(ЭКМЛУ, в скобках указан диапазон концентраций полимера, в котором наблюдалосьподавление МЛУ),ПолимерККМ, мкMККМ,ННКННК, мкМисоотношение ННК/ ЭКМЛУЭКМЛУ, мкMННК/ЭКМЛУI.
ПлюроникиL6111 ± 1100 ± 2010 (2 - 10)L64100 ± 25200 ± 50100 (4 - 100)F68800 ± 20024004500 ± 500(300102-1,92400)L813±115 ± 55 (1 - 5)3P8590 ± 30550 ± 15013 (3 - 13)42,3F8740 ± 1010001200 ± 200P1230,5 ± 0,1F127610 ± 140450 ± 1003500 ± 500(250-1,21000)1,2 (0,08 - 1,2)1600(40375-2,21600)REP20 ± 5450 ± 10020 (3 - 20)22,5II ПолиглицериныPG28±19±12 (0,6 - 2)3PG3045 ± 15170 ± 3070 (20 – 70)2,4PG76-24002800 ± 300P(G2)240 ± 1014 ± 2(200-1,22400)11 (2-11)1,3III. Углеводородсодержащий ПАВ и сополимер ПЭО и ПДМСBrij-3540 ± 1025 ± 116 (3 - 16)1,6ЭО54-ДМС715 ± 5600 ± 1505 (3 - 5)50Для оценки исследуемых в настоящей работе полимеров с этой точки зрения мырассчитали для каждого соединения соотношение ННК / ЭКМЛУ (табл.
8, рис. 30). Оказалось,что это соотношение для большинства полимеров варьирует от 1 до 3. У плюроника L61,который предложен как компонент лекарственной формы SP1049C [2, 105], это соотношениеравно 10. Тогда как наибольшим соотношением этих параметров обладает плюроник Р123, укоторого ННК / ЭКМЛУ = 375.93600300ННК / ЭКМЛУ80604020FPG87Br 76ij 35F68L6F1 4PG2730L8PG12L6R 1EPP8P1 5230 Рис.
30. Соотношение наибольших нетоксичных концентраций полимеров (ННК) и ихнаименьших концентраций, достаточных для максимального подавления устойчивости клетокк DOX (ЭКМЛУ)Таким образом, среди всех исследованных нами соединений плюроник Р123представляется наиболее подходящим для практического использования, если в этомвозникнет необходимость. Минимальная концентрация Р123, достаточная для подавленияМЛУ у клеток в культуре, составляет 0,007 мг/мл, тогда как его цитотоксичность начинаетпроявляться при концентрации более 2,5 мг/мл.3.4.4.Особенностидействиянекоторыхблок-сополимеровналекарственную устойчивость раковых клеток1 Блок-сополимеры L61, Р123, REP и ЭО54-ДМС7 в мицеллярной формеувеличивают жизнеспособность клеток не только в отсутствие, но и в присутствиидоксорубицина.
Так, например, в случае плюроника Р123 снижение количества клетокначиналось при его концентрациях выше 0,08 мкМ, когда он присутствует в растворе в видеюнимеров, и достигало минимума 46 - 52% при 1,2 - 1,3 мкМ полимера. Однако дальнейшееувеличение концентрации Р123 приводило к возрастанию количества клеток (рис. 31 А), даженесмотря на присутствие DOX. В интервале концентраций 2,5 - 60 мкМ Р123 количествоклеток увеличивалось до 70%.Аналогичная зависимость наблюдалась в случае двублочного сополимера ЭО54-ДМС7.Его юнимеры способствовали снижению количества клеток в диапазоне концентраций от 3мкМ до 5 мкМ (рис. 31 Б), что втрое ниже ККМ (15 ± 5 мкМ). Но в диапазоне концентрацийвыше ККМ (40 - 300 мкМ) этот полимер увеличивал количество клеток до 75%.
Такой жеэффект наблюдали после инкубации клеток в присутствии плюроника L61 и двублочногосополимера REP (данные не показаны). При этом блок-сополимеры L61, Р123 и ЭО54-ДМС794вызывали увеличение количества клеток в отсутствие DOX и в присутствии 5 мкг/мл DOXпрактически в одном и том же диапазоне концентраций (рис. 31).АКоличество клеток, %140120150100801006050402000,010,1110100 1000Концентрация плюроника P123, мкMИнтенсивностьфлуоресценции ДФГТ, усл. ед.200Б120150100801006040502000.11101001000Концентрация ЭО54-ДМС7, мкМИнтенсивностьфлуоресценции ДФГТ, усл. едКоличество клеток, %200Рис.
31. Зависимость количества клеток, выживших после инкубации с плюроникомP123 (А) и сополимером на основе полидиметилсилоксана ЭО54-ДМС7 (Б), добавленными вконцентрациях, указанных на оси абсцисс, в смеси с 5 мкг/мл DOX (●) и в отсутствие DOX (○).Приведены усредненные данные трех экспериментов с плюроником Р123 и двух – ссополимером ЭО54-ДМС7. Процесс мицеллообразования полимеров был исследован в том жедиапазоне концентраций в отдельном эксперименте и показан на рисунках как увеличениеинтенсивности флюоресценции ДФГТ (▲, правая ось ординат). Значения ЭКМЛУ, ККМ и ННКуказаны стрелками в порядке перечисления95Этот результат свидетельствует о том, что эффект поддержания жизнеспособностиклеток мицеллами полимера сохраняется вне зависимости от присутствия антибиотика.Отсюда следует, что эти амфифильные незаряженные блок-сополимеры, поддерживающиежизнеспособность клеток, не только можно использовать в минимальной концентрации,достаточной для подавления МЛУ, но и нецелесообразно применять в более высокойконцентрации для воздействия на злокачественные клетки.2.
Плюроники Р85 и L64, несмотря на способность поддерживать клетки вотсутствие DOX, не оказывали подобного воздействия в смеси с антибиотиком (рис. 29А). Возможным объяснением такого поведения этих полимеров может быть тот факт, что Р85и L64 имеют относительно высокие значения ККМ - 90 ± 30 мкМ и 100 ± 25 мкМ, и,следовательно, более широкий диапазон концентраций, при котором в растворе находятсятолько юнимеры.3. Для полимеров L81, PG2 и PG30 эффект поддержания клеток ни в отсутствие,ни в присутствии DOX вообще не характерен. По всей видимости, первые два сополимерачрезвычайно гидрофобны и поэтому погружаются в гидрофобную сердцевину мембраны вбольшей степени, чем гидрофильные полимеры.
В случае PG30 отсутствие эффектаповышенияжизнеспособностиклетокможнообъяснитьразветвленнойструктуройгидрофильного блока, который, в отличие от линейных плюроников со сходным ГЛБ (P85 иL64), не может распластываться по поверхности клеточной мембраны.4. Наиболее гидрофильные плюроники F87, F127 и F68 подавляли МЛУ, находясьв растворе в виде мицелл. Так, например, юнимеры F87 в диапазоне концентраций 15 до 40мкМ (ККМ) не только не снижали устойчивость клеток к препарату, но даже приводили кувеличениюихколичествадо120%.Этосогласуетсясэффектомподдержанияжизнеспособности клеток отдельными макромолекулами этих полимеров в отсутствие DOX(рис.
24). Подавление устойчивости под действием плюроника F87 начинает проявляться приконцентрациях больше ККМ, когда появляются мицеллы. Резкое снижение количества клетокпроисходит при концентрациях плюроника выше 250 мкМ и достигает 55% присубтоксической концентрации 1000 мкМ, близкой к значению ННК (табл. 8).
Таким образом,полимеры с высокой долей гидрофильных звеньев (70-80%) в виде отдельных макромолекул ив определенном диапазоне концентраций вызывали повышение количества клеток, не только вотсутствие, но и в присутствии DOX, а снижали устойчивость клеток к DOX только в видемицелл.965. Brij-35 и трехблочный полиглицерин P(G2)2 вызывали монотонное снижениеколичества клеток (рис. 32), вероятно вследствие высокого сродства их юнимеров кплазматической мембране клеток, как указывалось выше (п. 3.2.4).АКоличество клеток, %1201008010060405020000,1110100Концентрация Brij-35, мкMИнтенсивностьфлюоресценции ДФГТ, усл. ед.150Б10080Количество клеток, %100806060404020200110100Концентрация P(G2)2, мкМ0Интенсивностьфлюоресценции ДФГТ, усл.
ед.120Рис. 32. Зависимость количества клеток, выживших после инкубации с Brij-35 (А) иполиглицерином P(G2)2 (Б), добавленными в концентрациях, указанных на оси абсцисс, всмеси с 5 мкг/мл DOX (●) и в отсутствие DOX (○). Приведены усредненные данные двухэкспериментов. Процесс мицеллообразования полимеров был исследован в том жедиапазоне концентраций в отдельном эксперименте и показан на рисунках как увеличениеинтенсивности флюоресценции ДФГТ (▲, правая ось ординат).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
