Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Сопоставление значений ГЛБ и ННК полимеровпоказало, что полимерам с ГЛБ = 1 ÷ 3 свойственна ННК в диапазоне 10 ÷ 100 мкМ. В этугруппу входят гидрофобные сополимеры, у которых гидрофильный блок составляет около 10% масс.: плюроники L61, L81 и полиглицерины PG2 и P(G2)2. У более гидрофильныхполимеров с ГЛБ = 7 ÷ 17 значения ННК находятся в диапазоне 200 ÷ 600 мкМ. К нимотносятся плюроники P123, L64, P85 и двублочный REP, гидрофильный блок ПЭО которыхсоставляет30–50%масс.,полиглицеринPG30исополимернаосновеполидиметилсилоксана. Наконец, наиболее гидрофильные полимеры с ГЛБ = 25 ÷ 29характеризуются ННК = 900 ÷ 4500 мкМ. Таковы плюроники F68, F87, F127 и полиглицеринPG76, в которых гидрофильный блок составляет 70-80 % масс.О прямой связи между гидрофильно-липофильным балансом полимера и егоцитотоксичностью свидетельствует удовлетворительная корреляция между значениями IC50 иГЛБ полимеров в двойных логарифмических координатах (r2= 0,88) (рис.
17).72IC мкМ5010000PG76F127F68F87P85P123ЭО54ДМС7REP1000L61100PG30L64L81PG210110ГЛБРис. 17. Зависимость концентраций полимеров, при которых наблюдается гибель 50%клеток (IC50), от ГЛБДаннаязависимостьописываетсяlg IC50 2,1 lg ГЛБ 5,06 .уравнениемПотенцирование этого уравнения приводит к выражению IС50 (мкМ) = 8,71 ГЛБ2,1, покоторому можно рассчитать IС50 блок-сополимера, зная его ГЛБ. Предсказательнаяспособность обнаруженной эмпирической зависимости была проверена на синтезированных внашей лаборатории блочных и привитых сополимерах ППО и декстрана различного состава(табл. 6).
По формуле Гриффина были рассчитаны значения ГЛБ этих полимеров и, подставивих в вышеуказанное уравнение, мы получили значения IC50. Экспериментально определенныезначения IС50 оказались величинами того же порядка (табл. 6). Таким образом, обнаруженнаянами связь между ГЛБ и цитотоксичностью справедлива не только для линейныхамфифильныхблок-сополимеров,ноидлямакромолекул,имеющихархитектурумолекулярных щеток.Таблица 6.
Состав и свойства сополимеров ППО и декстранаПолимерMwMw/MnГЛБЗначение IC50, мкМККМ,мкМРассчитанноеЭкспериментальноеDex35 - ПO35115001,5150,4 ± 0,1722435 174Dex12 - ПO35114002,769,40,9 ± 0,1246666 30Dex300 - (ПO35)31056001,7180,3 ± 0,0412181 11Dex300 - (ПO35)5897001,6170,2 ± 0,06125167 11Возможность предварительного расчета области токсичных концентраций позволяетсущественно ускорить экспериментальное определение ННК нового полимера. Обычно этапроцедура занимает около месяца, поскольку в силу вариабельности этого параметра у разных73полимеров ее определение требует проведения 3 - 4 опытов.
Однако после предварительногорасчета ННК достаточно одного опыта для проверки и уточнения рассчитанной величины.Таким образом, проведенный анализ цитотоксичности блок-сополимеров различногостроения показал, что независимо от химической природы гидрофобного и гидрофильногоблоков, их соотношение определяет токсичность полимера для клеток в культуре: чем большезначение ГЛБ, тем выше концентрация полимера нетоксичная для клеток. Эта закономерностьхорошо согласуется с классическими работами К.
Ганша, показавшего на примере несколькихтысяч органических веществ, что токсичность соединения коррелирует с его гидрофобностью,определяемой по коэффициенту распределения в системе октанол/вода. Однако, наскольконам известно, аналогичные данные по высокомолекулярным соединениям в литературеотсутствуют.3.2.4.Сопоставлениецитотоксичностиимицеллообразованияисследованных соединенийПри рассмотрении взаимосвязи между структурой полимера, его физико-химическимисвойствами и цитотоксичностью возник вопрос, в какой форме полимер становится токсичнымдля клеток – в виде юнимеров или мицелл? Для ответа на этот вопрос мы сопоставилизначения ККМ полимеров и их концентрации, выше которых они становятся токсичными дляклеток (ННК).
Оказалось, что у Brij-35, Triton Х-100 и полиглицерина P(G2)2 ННК < ККМ(рис. 18 А). Это значит, что данные соединения проявляют цитотоксичность, когда ониприсутствуют в растворе в виде отдельных молекул (юнимеров). В случае Brij-35 и Triton Х100этообъясняется хорошей термодинамической совместимостью углеводородногофрагмента молекулы ПАВ с областью остатков жирных кислот липидной мембраны. Высокоесродство полиглицерина P(G2)2 к плазматической мембране клеток может быть объясненоэлектростатическим взаимодействием третичных атомов азота его молекулы, положительнозаряженных при физиологическом значении pH, и отрицательно заряженной наружнойклеточной мембраной. Это предположение подтверждается ранее опубликованными даннымио том, что третичные аминогруппы в составе Тетроников (этилендиамин алкилированныйблоками ПЭО и ППО по каждой аминогруппе) увеличивают их цитотоксичность поотношению к клеткам линии Caco-2 [124].Все остальные исследованные в настоящей работе блок-сополимеры становилисьтоксичными при концентрациях выше ККМ (рис.
18 Б). Этот результат свидетельствует о том,что они проявляют цитотоксичность только в виде мицелл. При концентрациях ниже ККМ онинетоксичны для клеток в культуре.240220200200020010007-2P(G2)X10nTritoBrij0806040200400054260ККМННК-ДМ--СККМННКL61L64F68L81P85F87P123F127PGPG 230RЭ EО P280БКонцентрация полимера, мкМА-35Концентрация полимера, мкМ74Рис. 18. Сопоставление критической концентрации мицеллообразования (ККМ) инаибольшей нетоксичной концентрации (ННК) исследованных соединений.
А – Brij-35, TritonХ-100; P(G2)2 c ННК < ККМ, Б – блок-сополимеры c ННК > ККМ. Гистограммы построены поданным, приведенным в табл. 4 (ККМ) и табл. 5 (ННК)Такимобразом,образованиемицелл-необходимоеусловиепроявленияцитотоксичности незаряженных блок-сополимеров, гидрофобный блок которых представленППО или ПДМС, а гидрофильный состоит из звеньев этиленоксида или глицерина. Этосвойство присуще как трехблочным (плюроники), так и двублочным (REP, ЭО54-ДМС7, PG2,PG30) сополимерам (рис. 18 Б).
Оно не зависит от соотношения масс гидрофильного игидрофобного блоков и от строения гидрофильного блока: ННК > ККМ и у плюроников,содержащих в качестве гидрофильного блока линейный ПЭО, и у полиглицеринов сразветвленным гидрофильным блоком из остатков глицерина.Возникает вопрос, почему же именно мицеллы блочных полимеров ответственны запроявление цитотоксичности? Можно предположить, что одновременное присоединение кклеточной мембране большого количества молекул сополимера в виде мицеллы приводит кмноготочечному взаимодействию полимера и липидов, как показано на рис.
3 Б. Увеличениеколичества контактов может приводить к изгибанию клеточной мембраны и формированиюобращенных мицелл полимера, ориентированных гидрофобными участками к липидаммембраны, а гидрофильными - в образующееся сквозное отверстие, через которое вытекаетводорастворимое содержимое клетки, что и приводит к ее гибели (рис. 19). 75 Рис. 19. Образование сквозного отверстия в наружной липидной мембране клетки поддействием мицеллы блок-сополимера.
Гидрофобный блок молекулы полимера окрашенкрасным цветом, а гидрофильные блоки – голубымДанное предположение согласуется с результатами работы Redhead с соавт., которыепоказали двумя методами, что инкубация клеток с плюрониками в токсичной концентрацииприводит к вытеканию белков из клеток в окружающую среду: гемоглобина из эритроцитов ифермента гликолиза лактатдегидрогеназы из эпителиальных клеток Сасо-2 [139]. Этотрезультат указывает на образование отверстий в наружной клеточной мембране достаточнобольших для прохождения таких крупных молекул как гемоглобин Мw 68000 илактатдегидрогеназа Мw 140000. Мы полагаем, что образование таких сквозных отверстийвозможно только при определенной концентрации молекул полимера на поверхности клетки,которая достигается присоединением мицелл.Итак, для исследования цитотоксичности полимеров была налажена методика анализатоксичности амфифильных блок-сополимеров по отношению к МЛУ клеткам линии MCF7/R.Для всех рассматриваемых в настоящей работе полимеров определена наибольшаянетоксичная концентрация (ННК) и концентрация, вызывающая гибель половины клеток(IC50).
Для 10 из 14 полимеров эти параметры определены впервые (табл. 5). Показано, что сувеличением гидрофильности полимера уменьшается его цитотоксичность и поэтомуувеличивается ННК (рис. 16). О прямой связи между гидрофильно-липофильным балансомполимера и его цитотоксичностью свидетельствует корреляция между значениями IC50 и ГЛБполимеров (рис.
17). Рассчитанные по этому графику значения IC50 новых амфифильныхнезаряженныхблок-сополимеровудовлетворительносовпалисэкспериментальноопределенными величинами (табл. 6). Сопоставление ННК и ККМ исследованных соединенийпоказало, что углеводородсодержащие ПАВ (Triton X-100 и Brij-35) токсичны в видеотдельных молекул (рис. 18 А). Впервые установлено, что амфифильные незаряженные блоксополимеры, гидрофобный блок которых представлен ППО или ПДМС, а гидрофильныйобразован звеньями этиленоксида или глицерина, цитотоксичны только в виде мицелл. Этосвойство присуще линейным сополимерам трехблочного и двублочного строения, а такжеполиглицеринам с разветвленным гидрофильным блоком.Таким образом, в настоящей работе было впервые проведено систематическое76исследование цитотоксичности ряда амфифильных блок-сополимеров и показано, что ихцитотоксическиеконцентрацииопределяютсясоотношениеммассгидрофильныхигидрофобного блоков, а само свойство – цитотоксичность – для большинства блоксополимеров обусловлено их способностью образовывать мицеллы.3.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
