Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Среднее последних двух значений совпадает сККМ, определенной нами (табл. 4).60Таблица 4. Критическая концентрация мицеллообразования исследованныхсоединенийСоединение 1.ЗначенияДанные литературыККМ,2. Близкие к3. Данные4. Данныеопределенные вполученным вAlexandridis сКабановым А.
В.снастоящейнастоящей работе,соавт., мкМсоавт., мкМработе, мкМмкМ[18]L6111 ± 1--110 [24]L64100 ± 25-1379 (35º) и480 [24]344 (40º)F68800 ± 2001400 [27]833312000 [28]1140 [26]480 [24]L813±1--23 [24]P8590 ± 3065 - 66 [29, 30] 100434 (35º)8,7 [28][31]F8740 ± 10--91 [24]P1230,5 ± 0,10,57 (43º) и 1,7 (35º)-4,4 (37º) [24][33] 2,5 (25ºC) [34]F1271,5 ± 0,5610±1400,8 [38],2,8 [39]4 (42º) [33]19 (35º) и 6-(40º)0,08 и 500 [37]635 [35], 800 [27]555 -794 [19, 36]PG28±1---PG3045 ± 15---PG76-1000 [60]--P(G2)240 ± 10---REP20 ± 537 [40]--240 ± 40279 [41]--40 ± 545 (30º) [42], 41 [43],----Triton X-100Brij-3585 [44]ЭО54-ДМС715 ± 5-61Одной из причин столь сильных различий в значениях ККМ полимеров, определенныхразными авторами, может быть гетерогенность самого полимера [48].
Это подтвердилирезультаты анализа препарата плюроника F127. При его взаимодействии с ДФГТ зависимостьИнтенсивностьфлюоресценции ДФГТ, усл. ед.интенсивности флуоресценции от концентрации полимера имела двуступенчатый вид (рис. 9).1401201008060402000.010.11101001000Концентрация плюроника F127, мкМРис. 9. Зависимость интенсивности флюоресценции ДФГТ от концентрации плюроникаF127. Концентрация ДФГТ – 0,25 мкМ. Приведены данные двух опытов, обозначенных ▲ и ●.Стрелками указаны два значения ККМЗначения ККМ, рассчитанные как показано на рис. 9, соответствовали 1,5 ± 0,5 мкМ и610 ± 140 мкМ.
Два значения ККМ у плюроника F127 (0,08 мкМ и 500 мкМ) были обнаруженытакже и другими авторами [37]. В ряде работ описаны только высокие (600 - 800 мкМ)значения ККМ [27, 35, 19, 36] или только низкие (0,8 - 4 мкМ) [33, 38, 39]. Таким образом,полученные нами значения ККМ плюроника F127 полностью совпали с данными литературы.Анализ этого полимерного препарата методом ГПХ выявил основной компонент с Мw= 12600, отвечающий полноразмерному плюронику F127, и низкомолекулярную примесь (Мw= 5500).
Поскольку плюроники получают полимеризацией ЭО на блоке ППО, длина ППО впримеси должна быть такой же, как в плюронике F127, т.е. содержать 69 звеньев ПО.Принимая молекулярную массу ПО-звена равной 58, а ЭО-звена – 44, был рассчитан составпримеси ПО69ЭО33. Массовое соотношение звеньев ПО и ЭО в ней почти такое же, как уплюроника Р123 – ПО70ЭО40. Поэтому мы полагаем, что значение ККМ = 1,5 ± 0,5 мкМ,близкое к ККМ плюроника Р123, принадлежит примеси. Тогда значение ККМ = 610 ± 140 мкМ– это ККМ полноразмерного плюроника F127. При анализе того же препарата F127 методомстатического светорассеяния мицеллы появлялись только при его концентрации более 550мкМ.
Этим методом не удалось зарегистрировать образование мицелл при концентрации62плюроника 1 – 10 мкМ. Повидимому содержание примеси в препарате F127 невелико.Таким образом, результаты исследования плюроника F127 подтвердили выводы P.Linse о влиянии состава полимерного препарата на его ККМ [48].В литературе обсуждался вопрос о том, что значение ККМ полимера также можетзависеть от выбранного метода его определения [27, 31]. Поэтому на примере двух блоксополимеров ПЭО и ППО – плюроника F127 и REP мы проверили результаты, полученные спомощью ДФГТ, методом статического светорассеяния. При определении указанным методомККМ плюроника F127 составила 550 мкМ, а для REP – 22 мкМ, что согласуется срезультатами определения ККМ по флуоресценции ДФГТ (табл. 4).
Таким образом, значенияККМ не зависели от метода их определения. К такому же выводу пришли авторы статей присравнении результатов определения ККМ методом поверхностного натяжения и сиспользованием флуоресцентных зондов [27, 31].В процессе работы по определению ККМ мы обнаружили фактор, который можетизменять кажущееся значение ККМ на порядок. По нашим наблюдениям на это влияетдиапазон концентраций полимера, исследованных в области до ККМ. Дело в том, чтофлуоресцентный метод определения ККМ с помощью ДФГТ основан на эффекте резкоговозрастания флуоресценции при его внедрении в гидрофобное ядро мицелл [41].Следовательно, в отсутствие мицелл интенсивность флуоресценции должна быть постояннанезависимо от концентрации полимера. Если в эксперименте увеличение концентрацииполимерасопровождаетсяпустьнебольшим,нонеуклоннымростомизмеряемойфлюоресценции, то определение ККМ по этим данным приведет к искажению результатов иполучению завышенных значений ККМ.
Сказанное можно проиллюстрировать результатамиэксперимента с плюроником F68 (рис. 10).По мере увеличения концентрации плюроника от 0,1 до 1 мМ наблюдалось постепенноеувеличение флюоресценции (рис. 10, кривая 1); в данном случае значение ККМ = 6 мМ. Вдиапазоне концентраций 0,002 – 0,1 мМ интенсивность флуоресценции колебалась околонекоего постоянного значения; в результате значение ККМ было определено более точно, ионо понизилось до 0,8 мМ (рис. 10, кривая 2). Таким образом, выбор анализируемыхконцентраций полимера действительно может изменить кажущееся значение ККМ в несколькораз. Поскольку последний вариант постановки эксперимента соответствует принципуиспользования ДФГТ в качестве теста мицеллообразования, мы полагаем, что значение ККМ0,8 мМ определено корректно.Интенсивностьфлюоресценции ДФГТ, усл.
е63100128060402001E-30,010,1110Концентрация плюроника F68, мМРис.10.ЗависимостьинтенсивностифлюоресценцииДФГТотконцентрацииплюроника F68. Диапазон концентраций плюроника F68 - 0,1 ÷ 12 мМ (1) и 0,002 ÷ 6 мМ (2).Стрелками указаны значения ККМ. Концентрация ДФГТ в обоих опытах – 8 мкМСдвиг ККМ также может быть следствием изменения свойств полимерного препарата впроцессеегохранения.Так,прианализеблочногосополимеранаосновеполидиметилсилоксана ЭО54-ДМС7, хранившегося при +4оС, было обнаружено, что наследующий день после приготовления раствора полимера, мицеллообразование начиналосьпри концентрации 15 ± 5 мкМ, а спустя трое суток значение ККМ увеличилось до 65 мкМИнтенсивностьфлюоресценции ДФГТ, усл.
ед.(рис. 11).Рис.11.120100128060402000,1Зависимость1101001000Концентрация ЭО54-ДМС7, мкМинтенсивностифлюоресценцииДФГТотконцентрациисополимера на основе полидиметилсилоксана. ККМ определяли после 20 ч (кривая 1) и 3суток (кривая 2) хранения при 4°С раствора 10% сополимера в воде. Стрелками указанызначения ККМ. Концентрация ДФГТ – 5 мкМВозможно ранее определенное в нашей лаборатории высокое значение ККМ = 167 мкМ[154] было получено на длительно хранившемся препарате ЭО54-ДМС7.64Такое повышение ККМ может быть вызвано изменениями в структуре мицеллполимера при его хранении. Действительно, в ходе анализа полимеров методомдинамического светорассеяния было обнаружено, что в процессе хранения раствораплюроника Р123 в PBS увеличивался размер мицелл (рис.
12).1Доля мицелл, %8060402020012345678Длительность хранения раствораплюроника Р123, сут.Рис. 12. Изменение размеров мицелл плюроника Р123 в процессе хранения. Кривая 1– доля мицелл радиусом 35-45 нм; кривая 2 – доля мицелл радиусом 7,3 нм. Раствор 10 мг/млР123 в PBS хранился при 40С.
Размеры мицелл определяли методом динамическогосветорассеяния с помощью гониометра лазерного светаСразу после растворения полимера при концентрации 10 мг/мл подавляющая долямицелл (80%) была небольшого радиуса (7,3 нм), а на следующий день их количествоуменьшилось до 30% и продолжало снижаться в процессе хранения (рис. 12, кривая 2). В то жевремя в этих образцах наблюдалось образование мицелл радиусом 35-45 нм, доля которыхпостепенно увеличивалась (рис.
12, кривая 1). Таким образом, при растворении плюроникаР123 в PBS сначала образуются мелкие мицеллы, которые при хранении при 40С сливаются.Таким образом, для всех 14 выбранных соединений были определены значения ККМ.При этом для полиглицеринов этот параметр был измерен впервые.
Для полимеров F127 иREP значения ККМ были получены двумя независимыми методами – по флюоресценцииДФГТ и методом статического светорассеяния. Значения ККМ плюроников F68, P85, F87,P123, F127 и поверхностно-активных соединений Triton X-100 и Brij-35 согласуются сбольшинством данных литературы.
Существенные расхождения значений ККМ былиобнаруженыдляплюрониковL61,L81иблочногосополимеранаосновеполидиметилсилоксана. Проведенный нами анализ возможных причин таких противоречийпозволяет заключить, что основными факторами являются гетерогенность препаратовполимеров, их изменение в процессе хранения и некорректное использование методаопределения ККМ с помощью ДФГТ.653.2.
Цитотоксичность исследованных соединенийНа первом этапе исследования биологических эффектов полимеров была определена ихсобственная токсичность для клеток (цитотоксичность), так как к началу работысистематических исследований в этой области не проводилось. Для этого была налаженаметодика определения токсичности полимеров для клеток в культуре, которая применяласьтакже для определения токсичности доксорубицина и влияния полимеров на устойчивостьклеток к нему.3.2.1. Определение цитотоксичности: обоснование методаКлетки инкубировали в течение 1 ч с раствором ксенобиотика (полимер, DOX или ихсмесь) разной концентрации, в среде без сыворотки. Контролем служили образцы клеток,которые инкубировали в бессывороточной среде без ксенобиотика.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
