Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Онзначительно (более чем в 2 раза) увеличивает модуль упругости мембран клеток гибридомы[183]. Его добавление в среду культивирования приводит к увеличению количества клеток вкультуре, например, фибробластов линии NIH/3T3 [184]. В его присутствии значительноускоряется восстановление целостности наружной мембраны фибробластов линии Swiss 3Т3после ее механического повреждения. Авторы предполагают, что влияние плюроникаобъясняется понижением поверхностного натяжения на границе мембрана-раствор [185].Аналогичный эффект плюроник F68 проявляет и по отношению к клеткам инфузорииTetrahymena [186] и к клеткам насекомых [187].
Он ускоряет восстановление клеточныхмембран, поврежденных в результате ионизирующего облучения или электропорации, такимобразом, предотвращая клеточный некроз [188, 189]. Плюроник F68 проявлял ряд защитныхэффектов при добавлении к клеткам нескольких линий СНО. Он препятствовал разрушениюклеток в условиях барботирования воздуха через культуральную среду и, как следствие,способствовал увеличению количества клеток. Он уменьшал адгезию клеток к подложке,восстанавливал целостность плазматической мембраны после обработки клеток трипсином[190] и амилоидными олигомерами [191].В связи с ярко выраженными защитными свойствами плюроника F68 по отношению кклеткам предложено использовать его в качестве криопротекторного компонента сред для39замораживания клеточных культур как в качестве самостоятельного препарата [192], так и всоставе эмульсий перфторанов в технологиях низкотемпературного консервирования органови тканей [193].
По всей видимости, в данном случае используется способность плюроникапонижать термодинамическую активность воды, усиливая тем самым гидрофобныевзаимодействия [194]. Вследствие этого при замораживании предотвращается кристаллизацияводы, приводящая к разрушению клеточных мембран при криоконсервации клеток и тканей.Кроме того, данный эффект плюроников может быть обусловлен их способностьюувеличивать эластичность клеточной мембраны и облегчать процесс ее восстановления послеповреждений, вызванных замораживанием - оттаиванием.Способность гидрофильных плюроников увеличивать прочность и эластичностьклеточных мембран объясняет их успешное использование при лечении ожогов. Исследованияна крысах показали, что систематическое применение плюроника F68 на ранних стадияхглубоких ожогов второй степени уменьшает углубление ран.
Возможным механизмомдействия полимера является его способность к «запечатыванию» мембран поврежденныхклеток и ингибированию воспалительной реакции [195].Еще одним сополимером, применяющимся для защиты клеток и тканей, являетсягидрофильный плюроник F127. Его мицеллы оказывали защитный эффект при обработкеклеток линий 3T3-MDEI, C2C12 и СНО ультразвуком [167]. Применение in vivo геляплюроника F127 на ранней стадии ожоговых поражений значительно ускоряет процессзаживления ран и стимулирует рост эпителиальной ткани [195, 196, 197]. Благодаря своимсвойствам плюроник F127 был включен в состав кремов и заменителей кожи для леченияожогов [198].Так же, как F68, плюроник F127 повышает жизнеспособность клеток [168, 182, 184].Например, инкубация клеток колоректальной карциномы линии DHD/K12/TRb с плюроникомF127 приводила к повышению их количества до 131 ± 22% по сравнению с контролем [168].Прирост клеточной массы в присутствии широкого диапазона (от 0,01% масс.
до 10% масс.)концентраций F127 был показан и на клетках линии NIH/3T3 [184].Такимобразом,исследования,проведенныезапоследниеполвека,яркопродемонстрировали способность плюроников F127 и F68 повышать жизнеспособность клетоки сформировали парадигму, согласно которой такой эффект характерен только для полимеров,гидрофильный блок которых составляет 70 – 80% массы макромолекулы.Однако, в последние годы в ряде работ было обнаружено, что сходные эффектынаблюдаются и в присутствии достаточно гидрофобных плюроников (L61, L122, P105, Р85),которые снижают микровязкость плазматических мембран клеток.
Мицеллы плюроника Р85(ГЛБ = 16) проявляли защитный эффект в условиях повреждающего воздействия ультразвука40на клетки трех линий 3T3-MDEI, C2C12 и СНО. В присутствии этого плюроника количествоклеток было близко к контрольным значениям, а при воздействии ультразвука даже высокойинтенсивности клетки оставались прикрепленными к субстрату [167].Плюроник Р85 способен не только защищать клетки от повреждений, но такжеповышать их жизнеспособность, что проявляется в увеличении количества клеток в культуре.Так, например, добавление этого плюроника в среду культивирования увеличило количествоклеток колоректальной карциномы линии DHD/K12/TRb до 172 ± 23% по сравнению сконтролем [168]. Авторы отмечают, что повышение жизнеспособности наблюдалось приконцентрацииполимера,соответствующейегоККМ.По-видимому,влияниенажизнеспособность клеток была обусловлена юнимерами плюроника Р85.Таким же неожиданным, как и в случае плюроника Р85, стал результат, полученныйпозднее теми же авторами для гидрофобного плюроника L61.
Через сутки после инкубации сэтим полимером в клетках DHD/K12/TRb наблюдалось повышение внутриклеточного уровняАТФ примерно на 25 – 30%, что говорило об увеличении жизнеспособности клеток. Следуетотметить, что данный эффект проявлялся при концентрациях плюроника до 110 мкМ идостигал максимума вблизи этой концентрации [182]. Добавление 0,01% масс. плюроника L61в культуральную среду увеличивало количество фибробластов линии NIH/3T3 [184]. Тот жеэффект был обнаружен и для других плюроников в широком интервале концентраций – L122,P105.
После инкубации с указанными полимерами наблюдалось увеличение количества клетокна несколько десятков процентов по сравнению с контролем [184].Несмотря на то, что защитные свойства плюроников известны достаточно давно,предположения, касающиеся механизма их действия, стали появляться сравнительно недавно.Высказано предположение, что мицеллы плюроников, имеющие гидрофильную опушку изПЭО-блоков, способны взаимодействовать с наружными мембранами клеток, формируя слои,которые и выполняют барьерную функцию [167, 190].Таким образом, анализ литературы показывает, что гидрофильные плюроникипроявляют ярко выраженные защитные свойства как in vitro, так и in vivo. Вероятнойпричиной такого эффекта может быть изменение микровязкости и модуля упругостиплазматической мембраны клетки.
Иных указаний в литературе на связь структуры и составаполимеров с их защитной ролью нам обнаружить не удалось. В частности, неизвестно, каквлияет структура и химическая природа гидрофильного блока на протекторное свойствополимера.Плюроники не только способны защищать клетки от вредных внешних воздействий, нотакже могут поддерживать их жизнеспособность, что следует принимать во внимание прииспользовании плюроников в медицинских целях, а особенно в противораковой терапии.41Увеличение количества клеток выше контрольных значений наблюдалось после инкубациикак с гидрофильными плюрониками, которые уплотняют клеточные мембраны, так и сгидрофобными полимерами этого класса, разжижающими мембраны.
В связи с этим, остаетсяоткрытым вопрос и о том, какие свойства и структурные особенности полимеровобусловливают увеличение количества клеток.Итак,анализлитературы,посвященнойвзаимодействиюамфифильныхблок-сополимеров с клетками, показал, что эти полимеры оказывают разные биологическиеэффекты, порой противоположные друг другу: в одном случае наблюдается гибель клетоквследствие токсического воздействия полимера или его влияния на устойчивость клеток клекарствам, в другом – увеличение жизнеспособности клеток, порой превышающееконтрольный уровень.
Настоящая работа посвящена выяснению вопроса, чем определяется тотили иной эффект полимера. Анализ этой проблемы может представлять интерес в случаеприменения изученных в настоящей работе соединений в медицинских целях.422. Э К С П Е Р И М Е Н Т А Л Ь Н А Я Ч А С Т Ь2.1. МатериалыВ работе были использованы следующие коммерческие реактивы:блок-сополимеры оксида этилена и оксида пропилена – плюроники: плюроникиF68, P85, L61 («Serva», Германия),плюроники F87 и F127 («Carbomer Inc.», США),плюроники L64, L81, P123 ("BASF", США);двублочный сополимер этиленоксида и пропиленоксида REP (НИОПИК,Москва), предоставленный профессором И.Н. Топчиевой;двублочный сополимер полиэтиленоксида и полидиметилсилоксана ЭО54-ДМС7( «Polysciencies, Inc.», США);Brij-35 («Serva», Германия);Triton X-100 («Ferak», Германия);блок-сополимерыпропиленоксидаиглицеринабылисинтезированывлаборатории профессора H.
Frey (Институт органической химии, Университет ИоаннаГуттенберга, Майнц, Германия);плюроники3H-P123,3H-L61 и ПАВ3H-Brij-35, меченные тритием, былисинтезированы доцентом кафедры радиохимии химического факультета МГУ Бадуном Г.А.Полимеры были очищены методом гель-проникающей хроматографии на носителе SephadexLH-20 («Amersham» США);флуоресцентныйдигидрохлорид),гидрохлоридкрасительDAPIдоксорубицина,(4',бромид6-диамидин-2-фенилиндол3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия (МТТ), изотиоцианат флуоресцеина (FITC, изомер I), карбонилдиимидазоли этилендиамин («Sigma», США);компоненты среды для культивирования клеток: эмбриональная сывороткакрупного рогатого скота («HyClone» США); среда DMEM (Dulbecco's Modified Eagle'sMedium), PBS (phosphate buffered saline tablets), pH 7,4, и антибиотики - пенициллин истрептомицин («Sigma» США); глютамин («ICN», США); раствор Версена («ПанЭко»,Россия), препарат от микоплазмы (micoplasma removing agent, MRA, «Biomedicals, Inc.,Япония»);дифенилгексатриен («Reanal», Венгрия);диметилсульфоксид (хч, «Реахим», Россия);тимидин, меченный тритием («Chemapol», Чешская Республика);43реактивы для радиоавтографии: фотоэмульсия (Autoradiography emulsion, TypeNTB «Kodak», США), фотохимические реактивы («Riedel - de haen», Германия).Параформальдегид («MP Biomedicals», Германия);Остальные реактивы – неорганические соединения и органические растворители(«Химмед», Россия).Все коммерческие препараты использовали без дополнительной очистки.Эпителиоподобные опухолевые клетки аденокарциномы молочной железы человека(MCF7 и MCF7/R) были любезно предоставлены Штилем А.
А. (Российский онкологическийнаучный центр РАМН им. Н.Н. Блохина, Москва).2.2. Методы исследования2.2.1. Определение молекулярно-массовых характеристик полимеровПлюроники L61, L64, F127, Р123, двублочный сополимер ПЭО и ППО (REP) и блочныйсополимер ЭО54-ДМС7 были проанализированы старшим научным сотрудником кафедрыВМС Гариной Е. С. методом гель-проникающей хроматографии при 35°С в ТГФ нажидкостном хроматографе «Waters» (США) с рефрактометрическим детектором и колонками,заполненными ультрастирогелем с размером пор от 103 до 105 Å и линейной колонкой.Хроматограммы обрабатывали на интеграторе «Data Module-730» с использованиемкалибровки по стандартным препаратам полиэтиленгликоля (ПЭГ).2.2.2. Определение ККМ с помощью флюоресцентного зондаККМ полимеров определяли по изменению интенсивности флюоресценции 1,6дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГТ), которая возрастает при солюбилизации ДФГТ вгидрофобном ядре образующихся мицелл полимеров [41].
3-4 мг ДФГТ (Мw=232) растворялив 1 мл ацетона, 50 мкл этого раствора вносили в 50 мл PBS и интенсивно перемешивалиполученный раствор в течение ≈ 2 ч до исчезновения запаха ацетона. Исследуемый полимер засутки до эксперимента растворяли в PBS и непосредственно перед опытом разводили донеобходимых концентраций. К 600 мкл каждого образца добавляли равный объем 10 мкМДФГТ (конечная концентрация флюорофора в каждом образце составляла около 5 мкМ).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
