Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Так,например, плюроник F127 не влиял на связывание нелфинавира с P-gp, но эффективнопрепятствовал взаимодействию белка с верапамилом [126]. Эти результаты указывают на то,что различные субстраты могут взаимодействовать с разными участками молекулы P-gp, чтоподтверждается в работе [127]. Таким образом, действие гидрофильных плюроников наактивность P-gp неоднозначна и требует дополнительного изучения.При исследовании зависимости эффекта полимера от его концентрации былообнаружено, что противоопухолевая активность лекарств в присутствии плюрониковувеличивается пропорционально концентрации полимера вплоть до ККМ, после чего неменяется или даже несколько уменьшается [24, 101, 102, 128]. Следовательно, подавлениеустойчивости опухолевых клеток обусловлено действием отдельных молекул плюроников –юнимеров, а не образованных ими мицелл.1.2.2.ПредполагаемыемеханизмыподавленияактивностиP-гликопротеина плюроникамиПервооткрыватели хемосенситизирующих свойств плюроников предположили, чтоплюроник Р85 подавлял МЛУ путем непосредственного специфического взаимодействия с Pgp [129].
Эту гипотезу поддерживали и другие исследователи [112, 113]. В пользу этогопредположения выдвигается тот факт, что плюроники увеличивают внутриклеточнуюконцентрацию лекарств в клетках, экспрессирующих P-gp, но не влияют на чувствительныеклетки, в которых P-gp нет [101]. Ранее в нашей лаборатории была предпринята попыткавыявить прямое взаимодействие амфифильного блок-сополимера с P-gp.
Для этого былиспользован сополимер ППО и ПЭО (REP), меченный тритием и конъюгированный сфотоактивируемойметкой-пара-1-трифторметилдиазиринил-бензойнойкислотой,содержащей высоко реактивную диазириновую группировку, способную при облучениигенерировать карбен, реагирующий с любым веществом в ближайшем окружении. Послеинкубации конъюгата с МЛУ-клетками линии MCF7/R выделяли белковую фракцию иразделяли белки методом SDS-электрофореза.
Анализ распределения радиоактивности вдольдорожки геля не выявил преимущественного связывания полимера с каким-либо белком, в28частности, с P-gp [130]. Этот результат подтверждают данные литературы о том, что прифизиологических условиях плюроники не взаимодействуют с белками, во всяком случае, сводорастворимыми.Так,методамигель-проникающейхроматографии,ультрацентрифугирования и спектроскопии кругового дихроизма было показано, что при 2040оС и нормальном атмосферном давлении такие белки, как бычий сывороточный альбумин, -химотрипсин и фитогемаглютинин не образуют комплексов с плюрониками, и полимерыне оказывают влияния на структуру белков. Такие результаты были получены для целого рядаплюрониковвбольшомэкспериментальногодиапазонеподтвержденияконцентрацийвзаимодействия[131].Такимамфифильныхобразом,полимеровпрямогосP-гликопротеином нет.В настоящее время в литературе обсуждаются две основные гипотезы воздействияплюроников на активность P-gp.
(1) Согласно одной из них, плюроники проникают внутрьклеток, связываются с митохондриями и, разобщая окислительное фосфорилирование,снижают содержание АТФ в клетке, что и приводит к уменьшению активности P-gp [132]. (2)Вторая гипотеза предполагает, что понижение активности P-gp инициируется внедрениемплюроников в наружную мембрану клеток и нарушением ее структуры: разжижениемлипидного бислоя, ускорением флип-флопа липидов и др. Ниже подробно рассмотрен каждыйиз этих предполагаемых механизмов действия плюроников на активность P-gp.1.
Механизм действия плюроников на МЛУ, предложенный А.В. Кабановым с соавт.,основан на трех экспериментально установленных фактах: проникновении плюроников,меченных флуоресцеином, внутрь клетки, уменьшении мембранного потенциала митохондрийи снижении уровня АТФ в клетках.Проникновение полимеров внутрь клеток было показано для плюроников, обладающихсредней гидрофобностью (ГЛБ < 20). На первичной культуре эндотелиальных клеток мозгабыка, выполняющих роль гематоэнцефалического барьера, было обнаружено, что плюроникис массовой долей ПЭО-блока, равной 10-50% (Р85, L64, P105, L81, L35 и L43), меченныефлуоресцеином, проникают в цитоплазму и накапливаются в клеточных органеллах и дажеядрах [116].
В этих экспериментах были получены убедительные фотографии полногосовпадения флюоресценции меченого плюроника Р85 и маркера митохондрий, что неоставляет сомнений в связывании меченого полимера преимущественно с митохондриями[133, 134]. Также показано проникновение плюроников Р123 и F127, меченных родамином В,в клетки и их аккумуляция в митохондриях [120]. При температуре 37°C транслокацияплюроника L64, меченного родамином, происходила довольно быстро – уже через пять минутпосле добавления полимера появлялась флуоресценция внутри клеток, которая с течениемвремени только возрастала.
Однако при 4°C ни взаимодействия с клеточной мембраной, ни29попадания плюроника внутрь клетки не наблюдалось. Эти результаты свидетельствовали отом, что плюроник попадает внутрь клеток путем эндоцитоза [135]. Причем, юнимеры имицеллы плюроников эндоцитируются различными путями. Юнимеры попадают в клетку врезультате захвата в кавеолы. Так, на примере плюроника Р85, меченного флюоресцеином,было показано, что эндоцитоз юнимеров происходит сравнительно быстро: флюоресценция вцитоплазме появляется уже через 15 минут после начала инкубации [134]. В то же времямицеллы проникают внутрь в результате более медленного процесса - путем захвата вмембранные везикулы, окаймленные сетью белка клатрина [136, 137].Взаимодействие плюроников с клетками приводит к уменьшению мембранногопотенциала митохондрий. Этот эффект наблюдали несколько разных групп исследователей[134, 138, 139, 140].
Например, плюроник L61 вызывал существенное понижениетрансмембранного потенциала митохондрий в клетках аденокарциномы человека линий HeLaи А549 [140]. По данным M. Redhead с соавт., плюроники L62, L31, P85, F68, P105,добавленные к клеткам линии Сасо-2, снижали трансмембранный потенциал митохондрий вразной степени и независимо от состава полимера. Интересно, что по данным этих авторовгидрофобный плюроник L121 не влиял на этот параметр, а наиболее сильный эффект вызывал0,3 мМ F68, который в этой концентрации не влияет на МЛУ. Авторы объясняют это тем, чтогидрофобные полимеры с высоким сродством к липидам наружной плазматической мембраныостаются в ней и не оказывают существенного влияния на мембранный потенциалмитохондрий [139].На выделенных митохондриях показано, что плюроник Р85 ингибирует белковыекомплексы I и IV дыхательной цепи, что приводит к разобщению окислительногофосфорилирования [134].
Этот эффект аналогичен действию ПАВ, например, таких, как TritonХ-100 [141].Взаимодействие плюроника с митохондриями, сопровождаемое уменьшением ихмембранного потенциала и ингибированием окислительного фосфорилирования, должноприводить к снижению количества АТФ в клетках. Действительно, на эпителиальных клеткахмозга линии BBMEC было продемонстрировано, что в присутствии плюроников происходитзначительное снижение уровня АТФ.
Причем вытекания АТФ из клетки во внешнюю среду ненаблюдалось [133]. Инкубация клеток с различными дозами плюроника P85 приводила квременному обеднению клетки энергией, уровень которой восстанавливался после удаленияполимера из среды. Сравнение влияния плюроника Р85 на уровень АТФ в клетках MCF7/R,содержащих P-gp, и не экспрессирующих этот белок (клетки MCF7), показало, что MCF7/Rклетки гораздо более чувствительны к действию плюроника. Для 50%-ного снижения уровняАТФ в этих клетках достаточной оказалась 0,009% концентрация плюроника Р85. Тогда как30для достижения такого же эффекта в чувствительных клетках MCF7 было необходимоувеличить концентрацию плюроникав250раз до2,25%[142,143].Снижениевнутриклеточного содержания АТФ вызывают также и другие амфифильные неионогенныеблочные соединения, такие как Cremophor EL, Solutol HS15, Tween 40, Triton Х-100 [144].Известно, что для функционирования P-gp необходим высокий уровень АТФ в клетке,поскольку на выброс каждой молекулы ксенобиотика расходуется 2 молекулы АТФ.
Поэтомууменьшение внутриклеточной концентрации АТФ, вызванное плюрониками, может бытьосновной причиной снижения активности P-gp и подавления МЛУ обусловленнойгиперэкспрессией этого белка [133, 118].Изложенный механизм действия плюроников оставляет некоторые вопросы. Дело втом, что исходное положение о проникновении плюроников внутрь клеток основано наисследовании полимеров, конъюгированных с флуоресцеином или родамином (рис.
6).АБРис. 6. Структурные формулы изотиоцианата флюоресцеина (А) и родамина В (Б)Между тем в нашей лаборатории было показано, что присоединение флюоресцеина кплюронику L61 и двублочному сополимеру ПЭО и ППО (REP) существенным образом влияетна физико-химические свойства полимеров: изменяет растворимость в воде, коэффициентраспределениявсистемевода/гексан,увеличиваетразмерассоциатов,образуемыхполимерами [145]. Кроме того, флюоресцеин (рис. 6, А) содержит ионогенные группы –карбоксильную (pKа ≈ 4) и гидроксильные (pKа ≈ 6,5) [146].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
