Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Поэтому он способен связыватьсяс митохондриальными белками - переносчиками отрицательно заряженных кислот, таких как,например, α–кетоглютарат, глутамат, аспартат [147] и транспортироваться в митохондрии поградиентурН.Приэтомоннеразобщаетокислительноефосфорилирование,ноаккумулируется в митохондриях [148, 149]. Эти свойства также характерны для родамина В(рис. 6, Б), который используется как сильный митохондриальный вектор, способныйпереносить в митохондрии ковалентно присоединенные к нему вещества [150]. Поэтому31нельзя исключить, что проникновение плюроников внутрь клеток и их транслокация вмитохондрии была обусловлена влиянием ковалентно присоединенных флюорофоров.2.
Вторая гипотеза базируется прежде всего на огромном количестве исследованийвзаимодействия плюроников с искусственными липидными бислоями: плоскими мембранамии липосомами [151, 152. 153, 154]. Результаты этих работ демонстрируют способностьплюроников связываться с липидами бислойной мембраны. Об этом свидетельствуютвызываемые ими изменения в структуре бислоя [65, 155] и его свойствах: увеличениеионофорной активности [156], проницаемости липосом для доксорубицина и ускорение флипфлопа липидов (перемешивание компонентов двух слоев мембраны) [56].
Эти эффектызависят от природы гидрофобного блока и его размера. Ускорение флип-флопа липидов влипосомах (f-f) возрастает с увеличением гидрофобности полимера (LogPвода-гексан) и объемаего гидрофобного блока (Vгидрофобный блок) (рис. 7).0,50,0Logf-fPPO30PG2PPO30PG30PPO30PG76C16PG10L64C16PG64-0,5-1,0-1,5L101L81P85L61P105F107F87Brij56-2,0F68-2,5Brij30Brij35-101230.182LogPвода-гексан+0.155Vгидрофобный блокРис.
7. Корреляция между влиянием плюроников () и полиглицеринов (PPO30PG2,PPO30PG30,PPO30PG76)()наскоростьфлип-флопафосфатидилэтаноламинасфлуоресцентной меткой (Logf-f) и линейной комбинацией гидрофобности полимеров(LogPвода-гексан) и объема гидрофобного блока (Vгидрофобный блок) [56]Сополимеры, содержащие блок ППО, в большей степени ускоряют флип-флоп липидови способствуют проникновению DOX, чем полимеры с углеводородными алифатическимицепями (Brij 30, Brij 35, Brij 56, C16PG10, C16PG64). Тем не менее, как те, так и другие,характеризуются тем, что их гидрофобные блоки встраиваются в бислой и дестабилизируютего. При этом, блок ППО в составе плюроников в большей степени дестабилизирует липидныйбислой, чем углеводородный блок ПАВ.
Еще сильнее мембрану дестабилизируютсополимеры, содержащие разветвленный блок полиглицерина (рис. 7). Повидимому,32двублочная архитектура полиглицеринов облегчает их внедрение в мембрану клетки посравнению с плюрониками.При переходе к рассмотрению взаимодействия полимеров с живыми клетками возниквопрос о том, к каким компонентам клеточной мембраны они присоединяются. Ввышеупомянутой работе с использованием сополимера ППО и ПЭО, меченного тритием иконъюгированного с фотоактивируемой меткой - пара-1-трифторметилдиазиринил-бензойнойкислотой, было показано, что при инкубации этого конъюгата с клетками он связывается слипидами, т.е. так же, как и в случае искусственных мембран [130].Связывание плюроников с липидами клеточной мембраны приводит к изменению еесвойств.
Основной эффект, вызываемый присоединением плюроников, заключается визменении подвижности липидов. Ускорение флип-флопа должно приводить к увеличениюколичества фосфатидилсерина на наружном слое мембраны, что предшествует снижениюмембранного потенциала митохондрий [78]. Увеличение подвижности липидов впервые былопоказано на нормальных лимфоцитах и раковых клетках в культуре в экспериментах поизмерениюанизотропиифлуоресценциизонда2,4,6-дифенилгексатриена(ДФГТ).Обнаружено, что подвижность зонда увеличивалась при добавлении плюроников L61 и Р85,что свидетельствует об уменьшении микровязкости клеточных мембран.
Авторы полагают,что было зафиксировано изменение микровязкости именно наружной мембраны клеток,поскольку по данным литературы ДФГТ внедряется в основном в плазматическую мембрану[157]. Оказалось, что способность разжижать мембрану характерна для плюроников,способных подавлять МЛУ. На клетках гематоэнцефалического барьера показано, чтоотносительно гидрофобные плюроники L121, L101, L64, P85, P106, L81 вызывали этот эффект,хотя и в разной степени [116]. Корреляцию между снижением устойчивости опухолевыхклеток и уменьшением микровязкости мембраны наблюдали в присутствии других ПАВ,содержащих полиэтиленоксид, - Твина 20 и Triton X-100 [158].
Блокирование выбросадаунорубицина под действием аналогичных ПАВ наблюдали и Woodcock с соавт, причемэффект детергентов также сопровождался значительными изменениями в микровязкостимембраны [159]. Эта закономерность нашла подтверждение в работе Dudeja с соавт., которыепоказали, что соединения, способные влиять на P-gp, одновременно вызывают и “разжижение”мембраны (Солютол HS-15, Твин 40, Кремофор E), в то время как индифферентные поотношению к мембране вещества, например октилглюкозид, не влияли и на МЛУ [160].Интересно, что гидрофильные плюроники F38, F108, F127, F88, являющиеся слабымихемосенситизаторами по сравнению с L61 или Р85, оказывают на мембрану противоположныйэффект - увеличивают микровязкость, тем самым уплотняя липидный бислой [116].33Известно, что активность P-gp, интегрированного в структуру мембраны, оченьчувствительна к состоянию ближайшего липидного окружения [161]. Для функционированияэтого белка (связывание субстрата и его выброс) необходима определенная взаимнаяориентация его трансмембранных и нуклеотидсвязывающих доменов [162].
Эта конформацияP-gp поддерживается окружающими его липидами, образующими область бислоя сповышенным содержанием холестерина («липидный плот») и вследствие этого более высокоймикровязкостью [163]. Интересно, что после инкубации клеток с плюроником Р85, меченнымфлюоресцеином,вконцентрациинижеККМлокализацияконъюгатасовпадаетсрасположением маркеров, специфичных к «липидным плотам» [136].
Присоединениеюнимеров Р85 в области липидных плотов может приводить к снижению их микровязкости и,как следствие, изменению конформации и ингибированию активности P-gp. Указаннуювзаимосвязь продемонстрировала Батракова с соавт. [133]. Авторы исследовали влияниеплюроника P85 на клетки эпителия микрососудов головного мозга теленка BBMEC, которыесодержат большое количество P-gp и могут служить моделью гематоэнцефалического барьера.Активность P-gp оценивали по количеству выброшенного из клеток субстрата этого белка –флуоресцентной метки родамина 123. Ингибирование этого процесса под действиемплюроника P85 коррелировало со значительным уменьшением микровязкости клеточныхмембран, которую определяли по анизотропии флюоресценции ДФГТ. В присутствииплюроника P85 происходило ингибирование АТФазной активности P-gp: снижаласьмаксимальная скорость гидролиза АТФ, и увеличивалась эффективная константа МихаэлисаМентен [164].
Авторы полагают, что наблюдаемое ингибирование может быть следствиемконформационных изменений белка, происходящих в результате уменьшения микровязкостиокружающей липидной мембраны.Приведенные факты позволили предположить, что плюроники ингибируют активностьP-gp, присоединяясь к липидам наружной клеточной мембраны и уменьшая ее микровязкостьв области липидных плотов, что приводит к изменению конформации белка и снижению егоактивности.Таким образом, анализ проведенных за последние 30 лет работ, посвященных изучениюустойчивости клеток к лекарствам, свидетельствует об актуальности этой проблемы иопределенных успехах в ее решении.
Разработаны разнообразные подходы для преодоленияустойчивости опухолей к лекарственным препаратам. Накоплен большой экспериментальныйи теоретический материал по структуре и механизму действия P-gp. Найдено огромноеколичество соединений способных подавлять его активность. Среди них - синтетическиеамфифильные блок-сополимеры – плюроники, особый интерес к которым вызван их высокойэффективностью. Исследована взаимосвязь между структурой полимера и его эффектом на34МЛУ.
Установлено, что полимеры, обладающие низким и средним значением ГЛБ = 2-20,полностью подавляют устойчивость раковых клеток к лекарствам.На протяжении последних 15 лет появилось большое число работ, посвященныхисследованию механизма подавления МЛУ под действием таких амфифильных ПАВ. Однакоединого мнения по этому вопросу до сих пор нет. Так, например, непонятно, обусловлена ливызываемая плюрониками сенситизация устойчивых клеток нарушением работы дыхательнойцепимитохондрийвследствиепроникновенияплюрониковвнутрьклетокилинеспецифическим влиянием на структуру и микровязкость наружной мембраны клеток.
Крометого,влитературепрактическинетсистематическихисследований,посвященныхопределению концентраций полимеров, достаточных для подавления устойчивости раковыхклеток к лекарствам. Также остается до конца не решенным вопрос о влиянии гидрофильныхплюроников на МЛУ.1.3. Токсичность плюрониковСпособность плюроников подавлять МЛУ привлекла внимание еще и потому, что онималотоксичны по сравнению с заряженными ПАВ [1].
Действительно, при тестированиигидрофильных плюроников F127 и F68 в диапазоне концентраций от 0,001 до 1% никакойтоксичности у этих полимеров для клеток в культуре (цитотоксичность) обнаружено не было[165, 166, 167, 168, 119] даже при длительной инкубации с клетками в течение 72 ч [166].Однако при тестировании на животных были выявлены побочные эффекты примененияэтих полимеров. Внутривенное введение F127 мышам вызывает гиперлипидемию –аномальное повышение уровня липидов и липопротеинов в крови, увеличивает содержаниехолестерина, что способствует формированию атеросклеротических повреждений аорты [169].Поглощение плюроника F127 эпителиальными и купферовскими клетками печени приводит ких вакуолизации и набуханию [170].Плюроник F68, входящий в состав препарата RheothRx для лечения инфаркта миокарда,при испытаниях на людях не вызывал осложнений даже в высоких дозах [171].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
