Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 13
Текст из файла (страница 13)
В отсутствие таких центров реакция восстановления непротекает; следовательно, они играют в этой реакции роль катализаторов. Далееприсутствующий в проявителе сульфит натрия реагирует с образовавшимся хиноном, образуямоносульфит гидрохинона, который восстанавливает ещё 2 иона серебра (реакция 7):C6H3NaSO3(OH)2+2AgBr+Na2SO3→2Ag+C6H2(NaSO3)2(OH)2+NaBr+HBr(7).Образовавшийся при этом дисульфонат гидрохинона C6H2(NaSO3)2(OH)2 проявляющейспособностью практически не обладает.
Таким образом, одна молекула гидрохинона вприсутствии сульфита натрия восстанавливает четыре молекулы бромида серебра. Допроявления центр скрытого фотографического изображения содержит обычно от несколькихатомов до нескольких десятков атомов Ag. После восстановления (проявления) микрокристаллсеребра содержит 108—1010 атомов Ag. Таким образом, проявитель в огромной степениувеличивает количество продукта первичной фотохимической реакции. После проявленияобразцы промывали дистиллированной водой и помещали на 15-20 мин в кислый закрепитель,содержавший 300 г/л тиосульфата натрия и 15 г/л метабисульфита натрия, последовательнорастворенных при 60-70ºС. Закрепитель переводит непрореагировавший бромид серебрафотографической эмульсии в водорастворимую комплексную соль согласно реакции 8:AgBr+2Na2S2O3→Na3[Ag(S2O3)2]+NaBr(8).В кислом закрепителе действие проявляющих веществ, оставшихся в фотоэмульсии,быстро прекращается, так как в кислой среде нейтрализуются щелочные компонентыпроявителя.
Затем образцы промывали 30 мин под слабой струей водопроводной воды,высушивали, на сухой образец наносили 10-15 мкл смеси PBS с глицерином (1:1) и накрываликлетки покровным стеклом, закрепляя его по краям лаком. Клетки фотографировали в режимефазового контраста на микроскопе (OPTON, Германия) при увеличении в 630 раз. Следуетотметить, что для получения четких изображений рекомендуется использовать образцыполимеров, радиоактивность которых не превышает 70 мкКи/мл.522.2.10. Получение конъюгата плюроника L61 с флуоресцеинизотиоцианатомВ связи с тем, что плюроник L61 содержит на концах молекулы гидроксильные группы,а FITC эффективнее взаимодействует с аминогруппами, конъюгат получали в две стадии и напервой стадии вводили в молекулу полимера концевую аминогруппу.а) Введение концевой аминогруппы в молекулу плюроникаСначала плюроник обрабатывали карбонилдиимидазолом.
Образовавшийся продуктотделяли и инкубировали с этилендиамином, который замещает имидазол в молекулеплюроника и образует 2-аминоэтилкарбаматную группу (реакция 9):NL61 OHNNONH2NL61 O CONNNH2L61 O CNHNH2(9)OL61-NH2Первая реакция чрезвычайно чувствительна к присутствию следов воды, поэтому еепроводили в стеклянной посуде, прогретой при +200°С в течение 2 ч, в абсолютированномдиоксане. Для обезвоживания диоксана его кипятили с металлическим натрием в течение 8 ч собратным холодильником и перегоняли при 99ºС.Плюроник L61, 0,5157 г (0,273 моль) осушили трёхкратной азеотропной отгонкой с 33,5 мл (всего 10 мл) бензола, абсолютированного металлическим натрием.
Безводный бензолнужен для удаления воды из L61 для того, чтобы карбонилдиимидазол реагировал с ОНгруппой L61, а не с водой. Использование бензола в данном случае обусловлено тем, что он, вотличие от металлического натрия, оксида фосфора (V) и других обезвоживающих реагентов,не взаимодействует с плюроником. К обезвоженному полимеру добавляли 0,7177 г (4,43ммоль) карбонилдиимидазола, что составляло 8-кратный молярный избыток по отношению кколичеству ОН-групп полимера. К смеси прилили 2 мл абсолютированного диоксана. Приэтом образовалась суспензия, которая быстро растворилась при 45°С.
Образец инкубировалипри 45ºС в темноте в течение 12 ч.Высокомолекулярный продукт отделили методом ГПХ на колонке сефадекса LH-20(2×70 см), уравновешенного этанолом. Поскольку в диоксане сефадекс коагулирует, то переднанесением на колонку образец упарили на роторном испарителе досуха, растворили в 2 млэтанола и нанесли на сефадекс. Элюировали этанолом со скоростью 8 мл/ч, объем фракции – 4мл. Появление полимера в элюате регистрировали с помощью спектрофотометрическогодетектора по поглощению при 230 нм, соответствующей поглощению карбонильных иимидазольных групп. Фракции, содержащие полимер, упаривали на роторном испарителе без53подогрева в предварительно взвешенном приемнике.
Сухой остаток (0,2323 г) растворили в 2мл этилендиамина и инкубировали 2 суток при комнатной температуре, в темноте, чтобыпредотвратить окисление этилендиамина (при окислении он желтеет). Затем этилендиаминудалили на роторном испарителе, сухой остаток растворили в 2 мл этанола и выделили L61NH2 методом ГПХ, как написано выше. Появление L61-NH2 в элюате регистрировали пореакции аминогрупп с тринитробензолсульфокислотой (ТНБС). Для этого к 2 мкл каждойфракции (3 параллельных пробы) добавляли 100 мкл 0,1 М бората натрия, рН 8,7, и 20 мклсвежеприготовленного раствора ТНБС, 3 мг/мл в воде.
Реакцию проводили в 96-луночномпланшете. Интенсивность окраски измеряли при длине волны 405 нм на многоканальномспектрофотометре Multiscan Plus (Titertek, Финляндия). Основная часть аминогруппнаходилась в свободном объеме колонки. Это означает, что обнаруженные аминогруппы былисвязаны с высокомолекулярным веществом в элюате, а именно, с плюроником L61. Выходпродукта L61-NH2 составил 74-82% от взятого количества L61.б) Конъюгация L61-NH2 c FITCКонъюгат L61-FITC получали согласно реакции 10:(10)FITC, 8,7 мг (10-кратный молярный избыток по отношению к количеству L61-NH2)растворили в 100 мкл ДМСО и прибавили к нему 100 мкл 0,1 М L61-NH2 , 100 мкл 0,2 Мбората натрия, pH 9,5, и 150 мкл ДМСО для просветления раствора.
Реакционную смесьинкубировали 23 ч при комнатной температуре. После этого отделяли высокомолекулярнуюфракцию методом ГПХ на колонке cефадекса LH-20 (1х30), уравновешенного этанолом, прискорости элюции 6 мл/ч и объеме фракции – 1 мл. Во фракциях определяли содержание FITC,измеряя на приборе Ultrospec 500/1100 pro, (Amersham Biosciences) поглощение при длиневолны 494 нм в 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, и принимая его коэффициент молярной экстинкции εравным 68000 см-1М-1. Конъюгат L61-FITC хорошо отделился от свободного FITC. Фракции,содержавшие L61-FITC, упарили на роторном испарителе и определили выход продукта повесу, который составил 97,4% от взятого количества L61-NH2.543.
Р Е З У Л Ь Т А Т Ы И И Х О Б С У Ж Д Е Н И ЕЦелью настоящей работы явилось выявление структурных особенностей и физикохимических свойств амфифильных водорастворимых соединений, которые обусловливают ихцитотоксичность и подавление устойчивости раковых клеток к лекарствам. В связи с этим дляисследования были выбраны соединения, гидрофобные и гидрофильные блоки которых имелиразную химическую природу, степень полимеризации и архитектуру.3.1 Характеристика исследованных соединений3.1.1. СтруктураВ работе использовали 16 амфифильных соединений: 14 блок-сополимеров и 2углеводородсодержащих ПАВ. Все соединения условно разделили на 4 группы (табл. 3):I группа - плюроникиЭто основная группа полимеров, которая представлена 8 соединениями - трехблочнымисополимерами полиэтилен – и полипропиленоксида, общей формулы АВА.
Это коммерческиепрепараты различной молекулярной массы, различающиеся по степени полимеризацииполипропиленоксида (ППО) (гидрофобный блок) и полиэтиленоксида (ПЭО) (гидрофильныйблок). Среди них можно выделить три подгруппы (I a, I б, I в), которые различаются длинойгидрофобного блока. Подгруппа I a представлена плюрониками L61, L64, F68, содержащими30 звеньев пропиленоксида (ПО). Во вторую подгруппу входят плюроники L81, P85, F87,гидрофобный блок которых состоит из 40 звеньев ПО. Третья подгруппа - плюроники F127,P123, у которых гидрофобный блок содержит около 70 звеньев ПО. Внутри каждой подгруппыплюроники различаются по длине гидрофильного блока при постоянном числе звеньев ПО.Так, плюроники с 30 звеньями ПО - L61, L64, F68 содержат 2, 13 и 76 звеньев этиленоксида(ЭО), соответственно.
В подгруппе I б с 40 звеньями ПО у плюроников L81, P85 и F87количество звеньев ЭО составляет 3, 26, 61 соответственно. А в подгруппе I в, полимеры F127и P123 имеют почти равные по длине гидрофобные блоки – 69 и 70 звеньев ПОсоответственно, в то время как блок ЭО содержит 100 (F127) и 20 (P123) звеньев (табл. 3).Таким образом, выбранные плюроники представляли широкий спектр соотношенийдлин их гидрофильных и гидрофобного блоков. Это отражается в значениях гидрофильнолипофильного баланса (ГЛБ), которые варьировали в широком диапазоне от 2 до 29 (табл. 3).55Таблица 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
