Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Затем среду инкубациизаменяли на полную культуральную и культивировали клетки без ксенобиотика в течение 3суток в стандартных условиях. По истечении этого периода определяли долю выжившихклеток относительно их количества в контроле.Такая схема анализа цитотоксичности была выбрана по следующим причинам.Длительностьинкубации спредварительныхксенобиотикомисследованийпоскорости(1 ч) основана нанакоплениярезультатахдоксорубицинавнашихклетках.Интенсивность его флюоресценции возрастает в течение первых 30 - 35 мин инкубации, послечего его количество в клетках остается постоянной (рис. 13 А).
Этот результат согласуется сданными литературы о скорости накопления даунорубицина в линии устойчивых клетоккарциномы яичника человека SKVLB, где было показано, что накопление антибиотика вклетках достигает постоянного уровня через 1 ч инкубации с лекарством [101]. Приведенныеданные свидетельствуют о том, что для тестирования влияния ксенобиотиков на клеткидостаточно их взаимодействия в течение 1 ч.Длительность культивирования клеток после удаления препарата была выбрана наосновании результатов предварительных экспериментов, которые показали, что гибель клетокнаиболее ярко выражена на третьи сутки после инкубации с антибиотиком (рис.
13 Б).Поэтому цитотоксичность ксенобиотика оценивали по истечении 3 суток после его удаленияиз среды культивирования.Посколькуполимерыразнойструктурымогутразличатьсяпоспособностивзаимодействовать с компонентами сыворотки с образованием комплексов, не токсичных дляклеток, то во избежание ее возможного влияния цитотоксичность полимеров и DOXанализировали в бессывороточной среде. Описанная схема анализа применялась во всехэкспериментах, выполненных в ходе настоящей работы: для определения цитотоксичности66DOX и полимеров, а также влияния полимеров на устойчивость клеток к DOX.Б30Количество клеток, %Интенсивностьфлюоресценции DOX, усл.
ед.А25201510520253035404512010018,5 ч80604048 ч2072 ч0-2050Время, мин100200300400Концентрация доксорубицина, мкг/млРис. 13. Внутриклеточное накопление и цитотоксичность доксорубицина (DOX): А –кинетиканакопленияDOXвклеткахMCF7/R,определеннаяпоинтенсивностифлюоресценции DOX в ядрах; Б – количество клеток MCF7/R, выживших после инкубации сDOX и последующего культивирования в стандартных условиях в течение 18,5 ч, 24 ч и 72 ч3.2.2. Токсичность доксорубицина для клеток MCF7/RЭксперименты проводили на раковых клетках человека линии MCF/R устойчивых кдействиюпротивоопухолевыхантибиотиков,вчастности,доксорубицину,которыйиспользуется в химиотерапии. Уровень устойчивости клеток определяли по концентрацииDOX, при которой наблюдается гибель 50% клеток ( IC50DOX ).
Во всех опытах использоваликлетки, у которых IC50DOX = 90-100 мкг/мл (рис. 14, ■). Для сравнения, IC50DOX клеток MCF7, необладающих устойчивостью к лекарствам, составляет менее 1 мкг/мл (рис. 14, ). В процессекультивирования клеток MCF7/R их устойчивость к DOX постепенно снижается до IC50DOX = 10– 20 мкг/мл (рис. 14, ). Чтобы ее поддерживать на уровне IC50DOX = 90-100 мкг/мл,требовалось периодически (не менее чем раз в месяц) культивировать клетки в присутствии 5мкг/мл DOX в течение 3 суток. Снижение устойчивости в процессе культивированиясвойственно не только клеткам MCF7/R, но также, например, и эритромиелобластоиднымклеткам линии K562/R.
Для поддержания устойчивости к лекарствам авторы культивировалиэти клетки постоянно в присутствии 1 мкг/мл DOX [138]. Для опытов по оценкебиологических эффектов полимеров использовали стимулированные клетки после двух - трехпересевов и культивирования в среде без DOX.67Количество клеток, %1201008060402000.010.11101001000Концентрация доксорубицина, мкг/млРис. 14.
Зависимость количества выживших клеток от концентрации доксорубицина:для исходной линии клеток MCF7, не обладающей устойчивостью к лекарствам (),устойчивых клеток MCF7/R () и клеток MCF7/R с пониженной устойчивостью (). СтрелкамиDOXуказаны концентрации лекарства, при которых количество клеток снижается до 50% ( IC50)3.2.3. Цитотоксичность исследованных соединенийТоксичность полимеров и ПАВ для клеток MCF7/R исследовали тем же методом, что итоксичность DOX, а именно, определяя долю клеток, выживших после одночасовойинкубации в бессывороточной среде DMEM в присутствии различных концентраций полимераи последующего культивирования без полимера в полной среде в течение трех суток.Зависимость количества выживших клеток от концентрации полимера описываетсясигмоидальной кривой, как показано на примере определения цитотоксичности плюроникаL81 (рис.
15). Цитотоксичность соединений принято характеризовать их концентрацией,вызывающей гибель 50% клеток (IC50), поскольку это наиболее точно определяемая величинана сигмоидальной кривой. Однако для наших последующих экспериментов по исследованиювлияния полимеров на токсичность DOX, в которых клетки инкубируют в смеси полимера иантибиотика, необходимо было добавлять полимеры в заведомо не токсичной концентрации,чтобы исключить их вклад в измеряемую цитотоксичность смеси. Поэтому при анализеполимеров нужно было выявить ту область их концентраций, в которой они не проявляютсобственную цитотоксичность. В качестве такой характеристики была выбрана максимальнаяконцентрация полимера, не вызывающая гибели клеток - наибольшая нетоксичнаяконцентрация (ННК). Ее определяли по графику как концентрацию, выше которой начиналосьснижение количества клеток (рис.
15). Так, ННК плюроника L81 варьировала в разных опытахот 10 до 20 мкМ, а IC50 составляла 40 ± 3 мкМ.68Количество клеток, %120100806040200110100Концентрация плюроника L81, мкМРис. 15. Зависимость количества выживших клеток от концентрации плюроника L81.Стрелками указаны ННК = 15 мкМ и IC50 = 40 мкМ. Приведены усредненные данные трехопытовИспользуя такой подход, были определены значения ННК и IC50 для всех полимеров(табл.
5). В ранее опубликованных работах была обнаружена цитотоксичность у четырехплюроников L61, L64, Р85 и Р123, и определена их ННК, выраженная в процентнойконцентрации (п. 1.3). Для сравнения с результатами, полученными в настоящей работе, этиданные литературы приведены в табл. 5 в молярной концентрации. Видно, что значения ННКкаждого из этих плюроников, определенные нами и большинством других исследователей,лежат в одной области концентраций. Так, например, по данным литературы ННК плюроникаL61 варьирует от 26 до 158 мкМ, а значение ННК, определенное нами, составило 100 ± 20мкМ. Полученное нами значение ННК плюроника L64 (200 ± 50 мкМ) соответствуетрезультатам Redhead с соавт.
[139]. Мы полагаем, что полученные нами значения ННКполимеровболееточные,т.к.дляихопределениямыподробноанализироваликонцентрационную зависимость, разбавляя полимеры в 2 раза, тогда как во всехопубликованных работах полимеры титровали с шагом в 10 раз.Существенные различия в значениях ННК для плюроников Р85 и Р123 обнаружены присравнении с данными работы [119].
Цитотоксичность полимеров, полученная этими авторамина устойчивых раковых клетках линии MCF7/R, оказалась очень высокой: ННК Р85 составила2,2 мкМ, а для Р123 этот параметр находился в диапазоне от 1,7 мкМ до 17,2 мкМ. Вероятно,столь низкие значения ННК обусловлены тем, что авторы инкубировали клетки в присутствииполимеров довольно долгое время – 72 ч, что намного превышает время инкубации,выбранное нами (1 ч) и другими авторами.Наши результаты не согласуются с данными Кабанова с соавт.
о цитотоксичности Р85,69полученными на перевиваемых клетках линий SKOV3 и SKVLB [101] и первичной культуреэпителиальных клеток сосудов мозга быка [133]. Согласно данным этих авторов данныйплюроник не токсичен вплоть до 5% концентрации (10870 мкМ), что на один - два порядкапревосходит наши результаты (550 ± 150 мкМ) и результаты других авторов (табл. 5).Следует особо отметить, что наши данные по ННК для плюроников L61 и L64 совпалис результатами работы Redhead с соавт. [139], которые анализировали цитотоксичностьплюроников, инкубируя клетки с полимерами в течение 5 ч в среде, содержавшей 10%сыворотки. Близость значений ННК, полученных в работе [139] и нами свидетельствует о том,что наличие 10% сыворотки в среде или ее отсутствие не оказывает существенного влияния нацитотоксичность плюроников.В целом ряде работ принято мнение, что гидрофильные плюроники F68 и F127 нетоксичны для клеток в культуре [119, 166, 167, 168].
Это мнение основано на результатахэкспериментов,в которых указанныеполимеры тестировалив концентрациях,непревышающих 1%. Однако по нашим данным эти полимеры обладают цитотоксичностью, ноона проявляется при более высокой концентрации: выше 3,8% (4500 мкМ F68) и 4,4% (3500мкМ F127). Таким образом, нам удалось впервые выявить токсичность гидрофильныхплюроников по отношению к клеткам в культуре и определить значения ННК этих полимеров(табл. 5). Также впервые были определены наибольшие нетоксичные концентрацииплюроников L81, F87, полиглицеринов и сополимера на основе полидиметилсилоксана (табл.5).Значения ННК исследованных полимеров варьируют в поразительно широкомдиапазоне концентраций, в пределах трех порядков: от 9 ± 1 мкМ (PG2) до 4500 ± 500 мкМ(F68).
Чем гидрофильнее блок-сополимер, тем он менее токсичен для клеток, т.е. клеткивыдерживают более высокую концентрацию полимера, что выражается в увеличении его ННК.Зависимость ННК от массы гидрофильного блока особенно демонстративна присравнении полимеров одной группы. Так, для полимеров, гидрофильность которыхопределяется количеством остатков глицерина в их молекуле, с увеличением их количества с 2до 30 и 76 гибель клеток становится заметной при более высокой концентрации полимера(рис. 16). Если блок-сополимер, содержащий 2 звена глицерина, становится токсичным дляклеток при концентрациях выше 10 мкМ (PG2), то при наличии 30 звеньев глицерина - приконцентрации более 170 мкМ (PG30), а с 76 глицериновыми звеньями - при концентрациивыше 2800 мкМ (PG76).Аналогичная зависимость была обнаружена и у плюроников. С увеличением массовойдоли гидрофильного блока ПЭО от 40% (L64) до 50% (P85) и 70% (F127) увеличивались изначения ННК с 200 ± 50 мкМ до 550 ± 150 мкМ и 3500 ± 500 мкМ, соответственно (табл.
5).70Прямо противоположное влияние на цитотоксичность оказывает гидрофобный блок.Увеличение количества звеньев ПО в плюрониках с 30 (L61) до 40 (L81) при почтиодинаковом содержании гидрофильных звеньев ЭО (4 и 6, соответственно) снижало ННК в 6раз (табл.
5).Таблица 5. Наибольшие нетоксичные концентрации (ННК) полимеров и концентрации,при которых наблюдается гибель 50% клеток (IC50)ПолимерННК, мкМIC50, мкМДанные литературы по ННК,мкМ26 [167]L61100 ± 20230 ± 4053 [139]158 [168]L64200 ± 50430 ± 20200 - 345 [139]F684500 ± 5008000 ± 1200> 1191 [119, 165, 166, 167, 168]L8115 ± 540 ± 32,2 [119]109 [167]P85550 ± 1502100 ± 300217 [168]1087 [176]> 10870 [101, 133]F871200 ± 2004080 ± 9201,7 – 17, 2 [119]P123450 ± 100910 ± 1501035 [167]1724 [165]> 800 [119, 166, 167, 168]F1273500 ± 5004800 ± 650REP450 ± 100900 ± 40-PG29±120±0,4-PG30170 ± 30340 ± 10-PG762800 ± 3004000 ± 100-(PG2)214 ± 224± 2-Brij-3525 ± 130 ± 0,8-Тритон X-10050 ± 860 ± 3-ЭО54-ДМС7600 ± 1501500 ± 200 [154]‐ > 4000 [165]71Количество клеток, %гидрофильность120100806040200110100100010000Концентрация полимера, мкM Рис.
16. Зависимость количества выживших клеток от концентрации сополимеровполиглицерина и ППО: PG2 (●), PG30 (▲) и PG76 (). Усредненные значения получены наоснове 2-3 экспериментов. Значения ННК полимеров показаны стрелкамиИнтересно отметить, что токсичность полимеров слабо зависела от особенностейхимической структуры гидрофильных и гидрофобного блоков, а в основном определялась ихсоотношением, т.е. ГЛБ сополимера. Так, плюроник L81 и блок-сополимер PG2, имеющиеблизкие значения ГЛБ около 1,5-2, проявляли сходную цитотоксичность (ННК равна 15 ± 5мкМ и 9 ± 1 мкМ, соответственно), несмотря на различную химическую природугидрофильных блоков этих полимеров.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
