Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 20
Текст из файла (страница 20)
В связи с этим возник вопрос, будет ли наш препаратплюроника L61 подавлять МЛУ в виде юнимеров при концентрациях меньше 11 мкМ или приконцентрации около 100 мкМ в мицеллярной форме.3.4.1. Влияние плюроника L61 на чувствительность раковых клеток кдоксорубицинуСначала для определения концентрации L61, оптимальной для подавления МЛУ, мыиспользовали общепринятую методику, которая позволяет наглядно показать и количественнооценить эффективность хемосенситизатора. А именно, клетки линии MCF7/R инкубировали вбессывороточной среде в присутствии различных концентраций DOX от 0,1 до 1000 мкг/мл вотсутствие плюроника L61 (контроль) и в смеси с фиксированной концентрацией полимера. Вразных сериях разведений DOX концентрация плюроника варьировала в диапазоне от 5 мкМдо максимальной нетоксичной - 97 мкМ.Добавление плюроника сдвигало кривую цитотоксичности DOX в сторону меньшихконцентраций (рис.
28).Количество клеток, %871005000.1110100Концентрация доксорубицина, мкг/млРис. 28. Кривые цитотоксичности DOX в отсутствие и в присутствии плюроника L61.Клетки линии MCF7/R инкубировали в течение 1 ч в бессывороточной среде, содержащейDOX в концентрациях, указанных на оси абсцисс, и в присутствии 0 мкM (○), 5,3 мкМ (×) 22мкM (), 27 мкM (), 53 мкM () and 97 мкM () плюроника L61. Количество выживших клетокопределяли спустя 3 дня после культивирования в стандартных условиях без DOX иплюроника. Каждый образец анализировали в трех параллельных пробахВ отсутствие плюроника концентрация DOX, при которой погибает 50% клеток, IC 50DOX ,составляет 113 мкг/мл.
Внесение 5,3 мкМ плюроника L61 в инкубационную смесь снижалоIC 50DOX почти в 4 раза до 28 мкг/мл. В то же время мы обнаружили, что максимальноеподавление МЛУ проявляется не только в концентрации около 100 мкМ, согласно даннымлитературы [24, 26], но и при концентрациях в 2-4 раза ниже - 22, 27, 53 мкМ. Причем, вдиапазоне 22 - 97 мкМ плюроника эффект был практически одинаков (рис.
28). Поэтому этиданные были объединены для построения кривой цитотоксичности. При концентрациях 22 - 97мкМ плюроника L61 значение IC 50DOX снижалось со 113 мкг/мл до 3,6 мкг/мл, т.е. в 31 раз.Эффективность действия полимера оценивали по доли устойчивых клеток, которыеприобрели чувствительность к DOX в присутствии полимера, в общем количестве устойчивыхклеток. Мерой количества устойчивых клеток может служить концентрация доксорубицина,при которой гибнет 50% клеток - IC50DOX . Тогда эффективность полимера как ингибиторарезистентности клеток (R) можно рассчитать по формуле II:R=DOXDOXIC50( устойчивые) IC50( устойчивые полимер )DOXDOXIC50( устойчивые) IC50( чувствительные )× 100%гдеIC50DOX (чувств.) – значение IC50DOX клеток линии MCF7, чувствительных к DOX;(II),88IC50DOX (устойчивые) – значение IC50DOX клеток линии MCF7/R, устойчивых к DOX;IC50DOX (устойчивые + полимер) – значение IC50DOX клеток MCF7/R в присутствииполимера.По нашим данным IC50DOX чувствительных клеток MCF7 составляет 0,6 мкг/мл (рис.
14),IC50DOX устойчивых клеток MCF7/R в отсутствие полимера равно 113 мкг/мл, а в присутствии 22- 97 мкМ плюроника L61 IC50DOX снижается до 3,6 мкг/мл (рис. 28). Подставив эти значенияIC50DOX в указанную формулу, мы рассчитали значение R для плюроника L61 равное 97%.Полученные результаты показывают, что плюроник L61 способен эффективно подавлять МЛУне только в концентрации около 100 мкМ, но и значительно ниже, указывая на существованиеминимальнойэффективнойконцентрацииполимера,достаточнойдлямаксимальновозможного подавления МЛУ (ЭКМЛУ).
Определение этой величины позволило бы подавлятьМЛУ, избегая высоких концентраций плюроников.Для точного определения ЭКМЛУ необходимо провести анализ на одних и тех жеклетках, подробно варьируя концентрацию полимера в широком концентрационноминтервале. Используя вышеописанный подход, основанный на измерении цитотоксичностидоксорубицинапрификсированнойконцентрацииполимера,решениеэтойзадачипредставляется затруднительным. Поэтому нами была разработана иная постановкаэкспериментов для определения ЭКМЛУ.3.4.2.Определениеминимальнойконцентрацииполимера,достаточной для подавления лекарственной устойчивостиНовая постановка опытов основана на общепринятом подходе, согласно которому длянахождения какой-либо величины нужно варьировать именно ее значение при проведенииэксперимента.
Поэтому с целью определения наименьшей концентрации полимера,достаточной для подавления МЛУ, мы решили варьировать концентрацию полимера, аконцентрацию DOX в смеси оставить постоянной. В качестве такой фиксированнойконцентрации было выбрано 5 мкг/мл DOX по следующим причинам. Первая заключается втом, что в отсутствие полимера 5 мкг/мл DOX - заведомо нетоксичная концентрацияантибиотика для клеток MCF7/R. В такой концентрации DOX не снижает количества клеток вотсутствие полимера (рис. 14, 28). Поэтому если при добавлении полимера произойдетснижение количества клеток, то это будет указывать на подавление МЛУ.Вторая причина состоит в том, что при этой концентрации DOX в присутствии 22 -97мкМ плюроника L61 количество клеток снижалось приблизительно на 50% (рис.
28), а этонаиболее точно определяемая точка на сигмоидальной кривой цитотоксичности.89Как показано на рис. 28, с ростом концентрации DOX количество клеток может бытьснижено практически до нуля, если концентрация полимера достаточна для максимальновозможного подавления МЛУ. Это означает, что в такой концентрации полимер подавляетустойчивость у всей популяции клеток, тем самым давая возможность препаратувоздействовать на все клетки. Но количество погибших клеток определяется концентрациейDOX. При выбранной нами концентрации, 5 мкг/мл DOX, количество выживших клетокдолжно снизиться вдвое, при условии, если полимер был добавлен в искомой концентрации,т.е.
достаточной для максимально возможного подавления МЛУ.Для определения этой концентрации, готовили серию разведений полимера вбессывороточной среде, содержавшей 5 мкг/мл DOX, и полученные образцы тестировали наклетках, как описано в п. 2.2.6. Таким образом, концентрация DOX во всех образцах былапостоянна - 5 мкг/мл, а концентрация полимера была разной.Как правило, для каждого опыта готовили две серии одинаковых разведений полимера:в среде с 5 мкг/мл DOX и без него. Вторая серия предназначалась для определенияцитотоксичности полимера.
Все образцы анализировали одновременно на одном и том жепланшете. Такая постановка эксперимента давала возможность в одном опыте на одной и тойжепопуляцииклетокопределятьтриразныхбиологическихэффектаполимеров:цитотоксичность, влияние на жизнеспособность клеток и минимальную концентрациюдостаточную для подавления МЛУ.В связи с этим в каждом опыте ставили два контроля.
Для анализа смеси полимера иDOX, контролем служили образцы, содержавшие 5 мкг/мл DOX в бессывороточной среде.При тестировании полимера без DOX, в контрольных лунках клетки инкубировали в среде бездобавок. Помимо использования этих образцов в качестве контроля, их сравнение позволялопроверять в каждом опыте устойчивость клеток к лекарству. Одинаковое количество клеток вобеих сериях контрольных лунок свидетельствовало о том, что 5 мкг/мл DOX не былитоксичны для клеток, использованных в данном опыте. Все ниже приведенные результатыбыли получены при выполнении этого условия.3.4.3. Зависимость степени подавления лекарственной устойчивости отконцентрации исследованного соединенияРезультаты, которые можно получить при использовании такой постановки опыта,представлены на рис.
29. На нем показана зависимость количества выживших клетокотносительно соответствующего контроля (левая ось ординат) от концентрации плюроникаР85, добавленного к клеткам в смеси с 5 мкг/мл DOX (●) или без него (○) (рис. 29 А).Инкубация клеток с DOX в присутствии полимера приводила к снижению их количества до9050% по мере увеличения концентрации Р85 от 3 мкМ до 13 мкМ (●), что указывает наподавление МЛУ.АКоличество клеток, %140120150100801006040502000.111010001000 10000Интенсивностьфлуоресценции ДФГТ, усл. ед.200Концентрация плюроника P85, мкМБКоличество клеток, %120100100808060604040202000.1110Концентрация PG2, мкМ1000Интенсивностьфлуоресценции ДФГТ, усл. ед.140120Рис. 29. Количество клеток, выживших после инкубации с плюроником Р85 (А) иполиглицерином PG2 (Б), добавленными в концентрациях, указанных на оси абсцисс, в смесис 5 мкг/мл DOX (●) и в отсутствие DOX (○).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
