Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Значения ЭКМЛУ, ККМ и ННКуказаны стрелками в порядке перечисленияТаким образом, наиболее гидрофильные плюроники с 70-80% масс. ПЭО, которые понашему предположению взаимодействуют с гликокаликсом, ингибируют МЛУ в высокой97концентрации, близкой к значениям ННК. А наиболее эффективно, в низкой концентрации,подавляют МЛУ те соединения, которые имеют повышенное сродство к сердцевинелипидного бислоя –углеводородсодержащий ПАВ Brij-35 и полиглицерин P(G2)2.
Этирезультаты указывают на то, что подавление МЛУ может быть обусловлено взаимодействиемгидрофобного блока амфифильных блок-сополимеров с областью остатков жирных кислот влипидной мембране клеток.Ранее в нашей лаборатории было исследовано влияние ряда рассматриваемых внастоящей работе соединений на липосомы и показано, что плюроники, полиглицерины и вменьшей степени ЭО-содержащие ПАВ способны ускорять флип-флоп липидов в липосомах[56]. Количественно этот эффект был описан параметром f-f(флипазная активностьполимера), который рассчитывали согласно формуле III ff 1CP vP 1 v0(III),гдеv p и v0 - скорость флип-флопа липидов в присутствии и в отсутствие полимера;Ср – концентрация полимера, мкМ.Нормирование на концентрацию полимера делает параметр f-fбезразмерным ипоэтому удобным для того, чтобы охарактеризовать способность полимера возмущатьлипидный бислой мембран.
Как было показано ранее, флипазная активность полимерапропорциональна объему гидрофобного блока V и общей гидрофобности полимера KP (рис. 7).Данная корреляция выражается уравнением:Lgβ = -1.4 + 0.122·Lg KP + 0.079·V, гдеKP – коэффициент распределения в системе вода-гексан [56].Иными словами, f-f – количественная характеристика способности полимераразупорядочивать структуру липидной мембраны.Сопоставление концентраций полимеров, при которых они подавляют МЛУ (ЭКМЛУ ), иих способности разупорядочивать стуктуру липидного бислоя (f-f) выявило корреляциюмежду этими параметрами (рис.
33). Чем больше значение f-f, т.е. чем больше способностьполимера нарушать липидный бислой, тем ниже концентрация полимера ЭКМЛУ, необходимаядля подавления устойчивости клеток к DOX. С ростом гидрофобности полимера егоспособность возмущать липидный бислой (f-f ) увеличивается, а минимальная концентрациядостаточная для подавления МЛУ (ЭКМЛУ ) снижается. Так, полимеры PG2, L61, L81 и P85,обладающие наибольшей флипазной активностью, подавляли МЛУ в значительно меньшихконцентрациях, чем плюроники F68 и F87, характеризующиеся невысокими значениями f-f98(рис.
33). Данной корреляции отвечали не только гидрофобные плюроники P85, L64, L81 иL61 и полиглицерины PG30 и PG2, но также и гидрофильные плюроники F68 и F87 (рис. 33).R=0,96ЭКМЛУ, мкМ1000F68F87PG30100L64101P85PG2L61L81Гидрофобность0.010.1-1f-f, мкMРис. 33. Корреляция между наименьшей концентрацией полимера ЭКМЛУ, достаточнойдляподавленияустойчивостиклетокMCF7/RкDOXиcпособностьюполимеровразупорядочивать структуру липидного бислоя в липосомах (f-f), определенной ранее [56]Эти результаты подтверждают, что подавление устойчивости раковых клеток вызвановзаимодействием гидрофобного блока амфифильных сополимеров с областью остатковжирных кислот липидной мембраны клеток, и именно гидрофобный блок амфифилов играетосновную роль в снижении резистентности раковых клеток.3.4.5.
Предполагаемый механизм подавления лекарственной устойчивостиНа основе полученных результатов можно предположить вероятный механизмподавления МЛУ полимерами. Взаимодействие исследованных соединений с наружноймембраной резистентных клеток вызывает дестабилизацию, изменения в структуре липидногобислоя (рис. 34). Это в свою очередь может оказывать влияние на работу трансмембранногобелка Р-гликопротеина, гиперэкспрессия которого обусловливает МЛУ клеток MCF7/R.Известно, что основная часть молекул P-gp находится в цитоплазматической мембране.Поэтому указанные эффекты полимеров могут иметь место, если полимер взаимодействуетименно с наружной мембраной клетки.Мы полагаем, что при взаимодействии амфифильного блочного полимера с наружнойплазматической мембраной клетки гидрофобный блок стремится к заякориванию в областиостатков жирных кислот липидов (рис.
34), а гидрофильный ПЭО-блок(и) – к формированиюводородных связей с углеводными цепочками на поверхности мембраны (рис. 26).99Рис. 34. Нарушение структуры липидного бислоя при внедрении гидрофобного блокаамфифильного полимера в наружную мембрану клеток.
Гидрофобный блок окрашен краснымцветом, гидрофильные блоки – голубымВ связи с этим, амфифильная природа исследованных в настоящей работе соединенийиграет наиболее важную роль в этом вопросе, так как степень возмущения липидноймембраны при присоединении полимера к ней зависит от общей гидрофобности полимера иобъема его гидрофобного блока. При наличии гидрофильного ЭО-блока(ов) большой степениполимеризации, что характерно, например, для плюроников F68, F87 и F127, взаимодействиеполимера будет происходить преимущественно с гликокаликсом, препятствуя проникновениюгидрофобного блока в ядро бислоя, что снижает возмущающее действие полимера наклеточную мембрану.
Вероятно, именно поэтому для подавления МЛУ гидрофильнымиполимерами необходимо добавлять их в высокой концентрации, превышающей ККМ. Впротивоположность им, полимеры с массивным гидрофобным блоком преимущественновзаимодействуют с сердцевиной бислоя, изменяя его структуру, и потому уже в небольшихконцентрациях (до ККМ) подавляют МЛУ.В свете такого представления о механизме подавления МЛУ становится понятным,почему блок-сополимеры из группы полиглицеринов также подавляют устойчивость клетокименно в виде юнимеров.
Разветвленный гидрофильный блок в составе полиглицеринов, какобсуждалось выше (п. 3.3), не может формировать водородные связи с углеводнымицепочками на поверхности клеточной мембраны. Поэтому гликокаликс не являетсяпрепятствием для заякоривания гидрофобного блока этих полимеров в бислой.Инаяхимическаяприродагидрофобногоблокаидвублочнаяструктурауглеводородсодержащего ПАВ Brij-35 обусловливают его повышенное по сравнению сполимерами других групп сродство к липидной мембране. В связи с чем, Brij-35 легкопроникает в область остатков жирных кислот.Высокое сродство трехблочного полиглицерина P(G2)2 к липидной мембране можетбыть объяснено их электростатическим взаимодействием, что, вероятно, должно усиливатьдестабилизацию липидного бислоя и объясняет нахождение ЭКМЛУ полимера в области доККМ.100В главе 3.3.
мы предположили, что полимеры увеличивают жизнеспособность раковыхклеток благодаря взаимодействию с углеводными цепочками, расположенными на наружнойповерхности клеток. Наши исследования влияния полимеров на устойчивость клеток к DOX показали, что те же соединения подавляют МЛУ, причем, судя по корреляции с их флипазнойактивностью, внедряясь в липидный бислой. Таким образом, при изучении биологическихэффектов полимеров на клетках в культуре (п.
3.2, 3.3, 3.4) мы интерпретировали полученныерезультаты, предполагая, что полимеры взаимодействуют с наружной клеточной мембраной.Для проверки правомочности такой интерпрерации мы исследовали на заключительном этапеработы локализацию полимеров при их взаимодействии с клетками.3.5. Исследование локализации рассматриваемых соединенийпри их взаимодействии с клеткамиКак известно, для анализа локализации различных соединений в клетках и тканяхшироко используются разнообразного рода метки, введенные в молекулу исследуемоговещества.
В настоящей работе были использованы в качестве меток флуоресцеинизотиоцианат(FITC) и радиоактивный тритий.3.5.1. Получение FITC-меченых блок-сополимеровПлюроник L61 и двублочный сополимер REP конъюгировали с FITC путемдвустадийного синтеза (п. 2.2.10). На первой стадии вводили в молекулу полимера концевуюаминогруппу. Для этого концевые гидроксильные группы L61 или REP активироваликарбонилдиимидазоломиконденсировалисэтилендиамином.Образовавшеесяаминопроизводное полимера выделяли из реакционной смеси методом ГПХ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
