Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Послеинкубации клетки отмывали от полимеров 2-8 раз. В ходе экспериментов мы обнаружили, чтоколичество отмывок от полимера не оказывает существенного воздействия на результатыопыта. Далее образцы фиксировали двумя способами так же, как в экспериментах с FITCмечеными полимерами, а именно - 4% формальдегидом в PBS или метанолом. Послефиксации покровные стекла с клетками отмывали от фиксатора, высушивали и наносили наклетки тонкий слой мелкозернистой ядерной фотоэмульсии фирмы Kodak. Затем образцыэкспонировали в течение 5-8 дней, и после проявления анализировали методом световоймикроскопии.На рис. 39 А приведены фотографии клеток после инкубации с 9 мкМ 3H-L61 ипоследующей фиксации 4% формальдегидом.
На снимках по периметру клеток отчетливовидны образовавшиеся гранулы серебра, формирующие четкий черный контур.Если бы плюроник проникал внутрь клеток, то следовало бы ожидать относительноравномерного распределения гранул серебра по всей поверхности клеток. Для проверки этогопредположения мы провели съемку образцов, изменяя фокусное расстояние, и обнаружили,что при его уменьшении четкий контур по периметру клеток сохраняется, что можнорасценить как указание на локализацию полимера на наружной мембране клеток (рис. 39 А).Важно отметить, что при использованной в данном опыте концентрации, плюроник L61вызывал максимальное подавление МЛУ (табл.
8). Четкая кайма сохранялась и в присутствииболее высоких, но не превышающих ННК, концентраций 3H-L61 (данные не показаны).107Ауменьшение фокусного расстоянияБ0,5 мкМ 3H-Р1231 мкМ 3H-Р1235 мкМ 3H-P123ВРис.39.Микрофотографии клеток MCF7/R после инкубации сполимерами и фиксации 4% формальдегидом. А – 9 мкМ3Н-мечеными3H-L61, 70 мкКи/мл, разноефокусное расстояние; Б – 0,5 мкМ (25 мкКи/мл), 1 мкМ (50 мкКи/мл) и 5 мкМ (50 мкКи/мл) 3HР123; В – 7,4 мкМ (47 мкКи/мл) Brij-35. Снимки получены на флуоресцентном микроскопеOptonСходная картина наблюдалась и после инкубации клеток с плюроником 3H-Р123. Прификсации клеток 4% формальдегидом четкая кайма по периметру клеток обнаруживается уже108при 0,5 мкМ плюроника (рис.
39 Б), то есть при концентрации, которая достаточна дляподавления МЛУ и образования мицелл полимера (рис. 31 А), а при 1 и 5 мкМ 3H-Р123 этотэффект еще более заметен (рис. 39 Б). Крупные размеры черных точек в местах образованиягранул серебра предположительно связаны с возможной агрегацией полимера на поверхностиклеток.Инкубация клеток с 7,4 мкМ Brij-35 с последующей фиксацией 4% формальдегидомпривела к образованию гранул серебра практически над всей поверхностью клеток, чтоподтвердило высокое сродство Brij-35 к липидной мембране (рис. 39 В).В то же время на клетках, обработанных 8 мкМ 3H-L61, но фиксированных смесьюэтанол-уксусная кислота, подобных гранул ни по контуру, ни в центре клеток обнаружено небыло (рис.
40 Б). Вид клеток в опытных образцах не отличался от контроля (рис. 40 А).Данные результаты свидетельствуют о том, что при растворении липидов этаноломпроисходит удаление и 3Н-меченого плюроника, что подтверждает ранее полученные данные отом, что тритий-меченый блок-сополимер 3Н-REP, содержавший фотоактивируемую меткутрифторметилдиазиринил на конце гидрофобного блока, присоединялся к клеточным липидам[130].АБРис. 40.
Микрофотографии клеток MCF7/R. Фиксация смесью этанол-уксусная кислота(3:1): А – контрольный образец без полимера; Б - после инкубации клеток с 9 мкМ 3H- L61, 70мкКи/мл. Снимки получены на флуоресцентном микроскопе OptonТаким образом, наличие гранул серебра на поверхности клеток после их инкубации с3H-мечеными полимерами и фиксации формальдегидом, позволяло предположить, чтополимеры локализуются преимущественно на наружной клеточной мембране. Однако,учитывая тот факт, что фотоэмульсия лежит на клетках и поэтому гранулы серебра не могутвыпадать нигде, кроме, как на поверхности клеток, мы решили проверить, могут ли 3Нмеченые соединения, попавшие внутрь клеток, после фиксации формальдегидом вызыватьвыпадение гранул серебра.109В качестве вещества, заведомо попадающего только внутрь клеток, был использован3Н-тимидин.
Клетки MCF7/R инкубировали с 3Н-тимидином в тех же условиях, что и в опытахс 3Н-мечеными полимерами. Известно, что тимидин включается в ДНК и, следовательно,может локализоваться только внутри клеток. Если обработка клеток 3Н-тимидином приведет квыпадению гранул серебра после фиксации формальдегидом, то это будет означать, чтовышеприведенные результаты экспериментов с3Н-мечеными полимерами могли бытьобусловлены их проникновением внутрь клеток.Однако оказалось, что после инкубации клеток с 3Н-тимидином и последующейфиксации формальдегидом выпадение гранул серебра не наблюдается вообще (рис. 41 А). Этозначит, что излучение трития, оказавшегося внутри клеток, не достигает фотоэмульсии, еслииспользован наиболее щадящий способ фиксации, в максимальной степени сохраняющийклеточные структуры – 4% формальдегид.В то же время после инкубации клеток с 3Н-тимидином и фиксации смесью этанола иуксусной кислоты на снимках видны четкие гранулы серебра над ядрами клеток (рис.
41 Б).Это значит, что растворение этанолом липидов клеточных мембран облегчает прохождениеизлучения трития, проникшего внутрь клеток вместе с тимидином. АБРис. 41. Микрофотографии клеток MCF7/R после инкубации с 2 мкКи 3Н-тимидина. А –фиксация 4% формальдегидом.
Б - фиксация смесью этанола и уксусной кислоты (3 : 1).Снимки получены на флуоресцентном микроскопе Opton при увеличении в 400 (нижниефотографии А и Б) Анализ результатов, полученных методом радиоавтографии, показал, что мы не можемотрицать возможность проникновения некоторого количества исследованных полимероввнутрьклеток,посколькуиспользованныенамиметодынедаютвозможностизарегистрировать излучение тритиевой метки, локализованной внутри клетки. Тогдаобразование гранул серебра в фотоэмульсии над клетками, связавшимисвидетельствует о локализации полимеров на наружной клеточной мембране.3Н-полимеры,110Таким образом, локализация полимеров при их взаимодействии с клетками былаизучена с использованием двух методик: флуоресцентной микроскопии и радиоавтографии.Использование двух разных подходов, а также варьирование способов фиксации показало, чтоFITC- и 3H-меченые полимеры локализуются в различных областях клеток: FITC-меченыепроникают внутрь клеток, тогда, как меченные тритием соединения в основномдетектировались на поверхности клеток.Сопоставление данных по цитотоксичности, влиянию полимеров на жизнеспособностьи лекарственную устойчивость клеток - и результатов радиоавтографии свидетельствует о том,что взаимодействия полимера с наружной клеточной мембраной достаточно для проявленияего биологических эффектов.111ЗАКЛЮЧЕНИЕЦель настоящей работы состояла в выявлении взаимосвязи между структурой,химической природой, способностью к мицеллообразованию водорастворимых неионогенныхамфифильных блок-сополимеров и углеводородсодержащих ПАВ и их биологическимиэффектами: влиянием на жизнеспособность опухолевых клеток и на их устойчивость кдействию лекарств.Основной группой проанализированных соединений были плюроники – трехблочныесополимеры пропиленоксида и этиленоксида.
К моменту написания данной работы влитературе имелись сведения о том, что плюроники в зависимости от степени полимеризациии соотношения гидрофильных и гидрофобного блоков в их составе характеризуютсяпреимущественно тем или иным биологическим действием. Было принято считать, чтонаиболее гидрофильные представители этой группы соединений, с большой длинойгидрофильного блока, обладают защитными свойствами по отношению к клеткам и тканяморганизма.
Также было известно, что более гидрофобные плюроники проявляют свойствахемосенситизаторов, снижая резистентность раковых клеток к лекарствам. Указанныеэффекты объясняют тот факт, что плюроники активно предлагаются для фармакологии имедицины. При этом механизмы биологического действия плюроников до конца не выяснены,их токсичность по отношению к клеткам в культуре (цитотоксичность) была изучена довольноскудно, а для некоторых наиболее гидрофильных плюроников она и вовсе не определена. Всеэто говорило о необходимости проведения систематического исследования данныхсоединений с целью ответа на вопрос, какие особенности структуры и физико-химическихсвойств плюроников лежат в основе их различных биологических эффектов, а также каквлияет химическая природа и архитектура блоков простых полиэфиров на их биологическиесвойства.Такого рода исследований в литературе не обнаружено.
В настоящей работе впервыепроведеносистематическоеизучениевзаимосвязихимическойприроды,структуры,способности к мицеллообразованию и биологических эффектов in vitro широкого кругаводорастворимых амфифильных блок-сополимеров. Было проанализировано 8 плюроников,различающихся по степени полимеризации гидрофильных и гидрофобного блоков, и 6 другихамфифильных простых полиэфиров, отличающихся от плюроников по структуре, а также похимической природе и архитектуре входящих в их состав блоков. Их эффекты сравнили сдействием двух ПАВ – Triton Х-100 и Brij-35, гидрофобная часть которых представленапредельными углеводородами.Наначальномэтапеработыбылисследованпроцессмицеллообразованиярассматриваемых соединений, а также их собственная токсичность по отношению к клеткам в112культуре.
Обнаружено, что образование мицелл незаряженными амфифильными блоксополимерамиявляетсянеобходимымусловиемпроявленияихцитотоксичности.Исключением стали углеводородсодержащие ПАВ и полиглицерин P(G2)2, цитотоксичностькоторых наблюдалась в присутствии их отдельных молекул. Анализ широкого наборасоединений, обладающих различным соотношением гидрофильного и гидрофобного блоков,выявил корреляцию между цитотоксичностью амфифильного блок-сополимера и значениемего гидрофильно-липофильного баланса. Полученная в результате эмпирическая зависимостьпредставляет практическую ценность, так как может служить для расчета примерногодиапазона цитотоксических концентраций амфифильного блок-сополимера, что позволяетзначительно сократить экспериментальную работу.Таким образом, в настоящей работе было впервые проведено систематическоеисследование цитотоксичности ряда амфифильных блок-сополимеров и показано, чтосоотношение масс гидрофильных и гидрофобного блоков в сополимерах определяет ихцитотоксические концентрации, а само свойство – цитотоксичность – для большинства блоксополимеров обусловлено их способностью образовывать мицеллы.Подробное исследование цитотоксичности позволило обнаружить эффект поддержанияжизнеспособности клеток в присутствии большинства рассмотренных в настоящей работеблок-сополимеров, содержащих в качестве гидрофильного блока линейный полиэтиленоксид.Для многих из них данный эффект был обнаружен впервые, в том числе и для ряда достаточногидрофобных плюроников, предлагаемых в качестве компонентов противоопухолевыхпрепаратов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
