Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки (1105748), страница 23
Текст из файла (страница 23)
На второй стадииL61-NH2 и REP-NH2 конъюгировали с FITC. Для этого аминопроизводные полимеровинкубировали в течение 23 ч при комнатной температуре в присутствии избытка FITC.Высокомолекулярную фракцию выделяли методом ГПХ на сефадексе LH-20, элюируя L61FITC и REP-FITC этанолом. Наличие флуоресцентной метки в полученных препаратах былодоказано спектральным анализом аминопроизводных полимеров, свободного FITC и ихконъюгатов, а также методом тонкослойной хроматографии. Поглощение FITC-меченыхполимеровпридлиневолны494нмпозволилорассчитатьсреднееколичествофлуоресцентных групп, приходящееся на одну молекулу полимера.
Согласно этим расчетам впрепарате L61-FITC на каждую молекулу полимера приходилось в среднем по одной молекулефлуоресцентного красителя. В препарате REP-FITC соотношение метка/полимер составлялооколо 0,74 моль/моль. С учетом этих данных были рассчитаны среднечисловые молекулярныемассы конъюгатов, которые составили 2280 для L61-FITC и 2460 для REP-FITC.1013.5.2. Влияние присоединенного FITC на свойства блок-сополимеровВведение FITC в молекулу полимеров прежде всего отразилось на их физическомсостоянии.
Если свободный плюроник L61 – жидкий, а REP – пастообразный, то их конъюгатыс FITC – твердые вещества [145]. Введение флуоресцентной метки уменьшило растворимостьплюроника L61 в воде почти в 2 раза (табл. 9). Для двублочного сополимера REP подобногоэффекта не наблюдалось, его растворимость не изменилась (табл. 9) [145].Таблица 9.
Сравнение свойств полимеров L61 и REP и их FITC-меченых аналоговОбразцыРастворимость в воде, мг/млIC50, мкМЭКМЛУ, мкMREP≥12,9900 ± 4020 (3 - 20)REP-FITC≥13,53>300040 (2,5 – 40)L61≥7230 ± 4010 (2 - 10)L61-FITC3,44320±4030 (10 – 30)Присоединение FITC повлияло и на биологические эффекты L61 и REP. Во-первых, обаполимера стали менее токсичными для клеток. Значения IC50 конъюгатов оказались выше дляобоих полимеров (табл.
9), причем, для REP-FITC оно увеличилось более, чем в 3 раза. Вовторых, введение FITC в молекулу REP или L61 ухудшило способность полимеров подавлятьМЛУ: минимальная концентрация, достаточная для подавления МЛУ (табл. 9, ЭКМЛУ), у REPFITC и L61-FITC повысилась в 2 и 3 раза по сравнению с соответствующимнемодифицированным полимером.Таким образом, присоединение флуоресцентной метки FITC к плюронику L61 идвублочному сополимеру REP оказывает заметное влияние на их физическое состояние,растворимость в воде, цитотоксичность и способность подавлять МЛУ.3.5.3. Исследование локализации блок-сополимеров флуоресцентнымметодомКлетки MCF7/R инкубировали с FITC-мечеными полимерами в тех же условиях, что ипри исследовании их биологических эффектов, а именно, в бессывороточной среде, в течение1 ч при 37°С в СО2-инкубаторе.
L61-FITC и REP-FITC тестировали в высокой концентрации ≤ННК, и в минимальной концентрации, достаточной для подавления МЛУ. После удалениянесвязавшегося FITC-меченого полимера клетки фиксировали 4% формальдегидом в PBS ианализировали препараты на флюоресцентном микроскопе Opton при λex = 470-490 нм и λem= 520-550 нм.102На рис. 35 представлены микрофотографии клеток после их инкубации с 80 мкМполимера L61-FITC, то есть при концентрации близкой к значению ННК (табл. 5). На этихфотографиях заметна яркая флуоресценция L61-FITC внутри клеток. Следует отметить,аутофлуоресценция клеток MCF7/R в наших условиях опыта не регистрировалась, то есть чтоконтрольные образцы клеток, которые инкубировали в среде без FITC-меченых полимеров, нефлуоресциировали (данные не приведены).Рис. 35.
Микрофотографии клеток MCF7/R после инкубации с 80 мкМ L61-FITC. Слева–флуоресцентныйрежим,справа–режимфазовогоконтраста.Фиксация4%формальдегидом. Снимки получены на флуоресцентном микроскопе OptonПри инкубации клеток с L61-FITC в концентрации ниже ККМ (8 мкМ) флуоресценциябыла гораздо слабее (данные не приведены), но оно достоверно отличалось от контроля. Этопоказало, что в клетку могут проникать юнимеры.Аналогичные результаты были получены при взаимодействии клеток с 400 мкМ и 40мкМ REP-FITC – и в той, и в другой концентрации полимер проникал внутрь клеток (данныене показаны).Эти данные были подтверждены при анализе образцов на конфокальном микроскопе(рис.
36). На этих фотографиях флуоресцентная метка отчетливо видна в цитоплазме особеннов области около ядра, где обычно наблюдается скопление митохондрий. Таким образом, этирезультаты подтвердили внутриклеточную локализацию FITC-меченых полимеров.Таким образом, результаты всех этих опытов выявили аккумуляцию L61-FITC и REPFITC внутри клеток. Эти данные полностью подтверждают результаты Батраковой с соавт.,полученные с использованием FITC-меченых плюроников L35 и Р85. Авторы показали, чтоэти полимеры также проникали в клетки и локализовались в цитоплазме и клеточныхорганеллах [116].103Рис.
36. Микрофотографии клетки MCF7/R, полученные с помощью конфокальнойфлуоресцентной микроскопии, в флуоресцентном режиме (1), в режиме фазового контраста(2), при наложении вышеприведенных двух фотографий (3). Клетки инкубировали с 80 мкМL61-FITC и фиксировали 4% формальдегидом. Анализ образцов на лазерном сканирующемконфокальном микроскопе LSM510 (Carl Zeiss, Германия) был проведен проф. Д.
Б. ЗоровымВ вышеописанных экспериментах c L61-FITC и REP-FITC часть клеточных образцовпосле инкубации с полимерами фиксировали в течение 10 - 15 мин. смесью этанола иуксусной кислоты (3 : 1) при комнатной температуре или метанолом при -24ºС. Использованиеспиртовой фиксации было вызвано тем, что согласно ранее полученным данным [130], 3НREP,конъюгированныйсфотоактивируемойметкой(трифторметилдиазиринил),присоединяется к липидам при инкубации с клетками MCF7/R. Поскольку липидырастворяются в спиртах, то можно было ожидать, что фиксация клеток спиртом приведет кудалению липидов и связанного с ними FITC-меченного полимера.Однако вопреки нашим ожиданиям яркая флуоресценция в цитоплазме клетоксохранялась и после их фиксации спиртовым раствором (рис.
37). FITC-меченые полимеры,способные проникать внутрь клетки и накапливаться в цитоплазме, не вымывались этанолом,несмотря на то, что полимеры L61 и REP, а также их FITC-меченые конъюгаты хорошорастворяются в спирте. 104Рис. 37. Микрофотографии клеток MCF7/R после инкубации с 80 мкМ L61-FITC. Слева– флуоресцентный режим, справа – режим фазового контраста. Фиксация смесью этанола иуксусной кислоты (3:1). Снимки получены на флуоресцентном микроскопе OptonПри оценке результатов опыта с использованием фиксации смесью этанола и уксуснойкислоты возник вопрос о том, в полной ли степени происходит экстракция липидов измембран клеток или остаточная флуоресценция обусловлена наличием FITC-меченныхполимеров на неэкстрагированных липидах.Для проверки полноты экстракции липидов был использован флуоресцентныйкраситель октадецил-родамин-В-хлорид (родамин В, R18), имеющий высокое сродство клипидам наружной клеточной мембраны [208].
Накануне опыта клетки высевали в чашкиПетри, на следующий день отмывали от культуральной среды с помощью PBS и добавлялиродамин В в концентрации от 2 до 20 мкМ в PBS. После одночасовой инкубации прикомнатной температуре клетки снова промывали PBS и фиксировали двумя способами: 4%раствором формальдегида в PBS или метанолом. Было обнаружено, что при фиксации клетокформальдегидом в образцах наблюдалось яркое свечение родамина (рис.
38 А), а послефиксации метанолом – окраски практически не было видно (рис. 38 Б). Расчет интенсивностифлуоресценции родамина при анализе образцов на конфокальном микроскопе «Olimpus»(анализ проводил ст. н. сотр. Физического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова А. А. Ежов)показал, что остаточная флуоресценция составила 5%.Резкое снижение флуоресценции родамина В после фиксации клеток метаноломсвидетельствует о том, что спирт экстрагировал липиды из клеточных мембран практическиполностью.
Отсюда следует, что FITC-меченые полимеры, которые оставались в клетках послеспиртовой фиксации, были связаны не с липидами. 105АБРис. 38. Микрофотографии клеток MCF7/R после инкубации с 7 мкМ родамина В: А –фиксация 4% формальдегидом; экспозиция при фотографировании - 0,066 сек. Б – фиксацияметанолом;экспозицияприфотографировании-1,27сек.Снимкиполученынафлуоресцентном микроскопе OptonИзвестно, что FITC оказывает существенное влияние на взаимодействие конъюгата стеми или иными компонентами клетки. Так, например, присоединение более трех молекулFITC к молекуле столь крупного белка как антитело (М.
м. = 150 000-180 000 Да) приводит квозрастанию неспецифического связывания конъюгата с клеточными структурами [209].Поскольку плюроник L61 гораздо меньше (М.м. 2000 Да), то его конъюгация даже с одноймолекулой FITC может повлиять на локализацию L61-FITC в клетках. Известно, что благодаряналичию ионогенных групп (карбоксильной и гидроксильных) FITC способен связываться смитохондриальными белками - переносчиками отрицательно заряженных кислот и проникатьв митохондрии [147, 149]. По-видимому, именно взаимодействие FITC с белками митохондрийобусловливает локализацию FITC-меченых полимеров внутри клеток.Все эти соображения указывали на необходимость проверки результатов, полученных сиспользованием FITC-меченых полимеров.3.5.4.
Исследование локализации методом радиоавтографииДля анализа локализации полимеров в клетках методом радиоавтографии былиполучены полимеры меченные тритием. Этот изотоп используется при радиоавтографииклеток, поскольку пробег бета-частицы трития в биологических тканях значительно меньшегеометрических размеров клеток и согласно расчетным данным составляет 6 мкм, а поэкспериментальным данным – около 1 мкм [210].
Это увеличивает точность локализацииобъекта в клетке.106В качестве объектов исследования мы выбрали Brij-35 и плюроники L61 и Р123. Накафедре радиохимии Химического факультета МГУ в эти соединения вводили радиоактивнуюметку методом термической активации трития. Полимеры отделяли от легко обмениваемоготрития рядом последовательных циклов растворения в этаноле и упаривания в вакууме, послечего очищали от продуктов радиолиза с помощью ГПХ. Удельная радиоактивностьполученных меченых соединений составила 13,9 Ки/ммоль, 48,3 Ки/ммоль и 6,5 Ки/ммоль для3H-L61, 3Н-Р123 и 3Н-Brij-35 соответственно, что означает присоединение в среднем от 0,5 до1,7 атома трития на макромолекулу.Ранее методами масспектрометрии и ЯМР было показано, что мечение плюроника L81радиоактивным изотопом углерод-14 не приводило к изменению структуры исходногополимера [211].
Согласно исследованиям Г.А. Бадуна с сотр. введение трития практически невлияет на свойства облученных соединений [212]. В связи с этим, мы полагаем, что заменаодного водорода на тритий в молекуле полимера массой около 2000 Да, не могла оказыватьсущественного влияния на свойства полимера. Это является важным преимуществом данногометода по сравнению с использованием флюлоресцеина в качестве метки.Полученные образцы в различных концентрациях добавляли к клеткам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
