Диссертация (1097910), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Распластанные клетки (фотографияна левом верхнем углу) приобретают сферическую форму через 48 мин.138Рис. 3.2.2 Динамика открепления одиночной клетки (клеточная линия3Т3) от субстрата на основе поли-N-ИПААм, полученного методомцентрифугирования. Фибробласты линии 3Т3, толщина покрытия - 100нм.Рис. 3.2.3. Открепление пары взаимодействующих фибробластов линии3Т3, от субстрата на основе поли-N-ИПААм, полученного методомцентрифугирования.
Толщина покрытия - 100 нм139Открепление клеток от термочувствительного покрытия происходитв результате набухания и, в конечном счете, растворения полимера вводной среде. Следовательно, можно предположить, что основнымфактором, определяющим скорость открепления является гидрофобностьсополимеров.
Результаты экспериментов подтверждают эту гипотезу.В таб.3.2.1 приведены характерные времена открепления клеток линииL929 с различных сополимеров.Таблица 3.2.1. Скорость открепления клеток линии L929 от покрытийна основе поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) .ПолимерыВремя, минполи-N-ИПААм0.5±0.5поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм); 85%:15% 2.0±0.5поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм); 65%:35%30.0±5.0поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм); 50%:50%180.0±15.0Из приведенных данных следует, что при культивировании клетокнамикронныхпленкахоптимальнымисоотношениямимономеровявляются 85%:15% и 65%:35%. Характерные времена открепления клетоксэтихсополимеровсовпадаютстрипсинизации и последующего открепленияхарактернымивременамиклеточных культур (5-10мин).Как и в случае традиционной трипсинизацииклеток,скоростьоткрепления в сильной степени зависит от типа клеточной культуры.
Втаб. 3.2.2. приведены сравнительные характеристики открепления 7-митрансформированных клеточных линий.140Таблица 3.2.2. Время открепления трансформированных линий клетокот покрытия на основе поли-N-ИПААм, полученного методомцентрифугирования.С330Времяоткрепления,%открепившихсяклетокCaSkiSiHaA549HeLaSW480 HaCat5 мин 60 мин 5 мин 5 мин 10 мин5 мин5 мин100%100%100%30%Нами было исследовано100%100%100%влияние факторов адгезии на скоростьоткрепления клеток. В этой группе экспериментов изучалось откреплениеклеток линии 3Т3 от покрытий на основе поли-(N-ИПААм-со-N-третБААм), полученных методом высушивания из раствора.Динамикаоткрепления клеток линии 3Т3 от покрытия на основе поли-(N-ИПААмсо-N-трет-БААм),(мол.отношение(85:15))модифицированноголаминином (А) и коллагеном типа I (Б) приведена на рис.
3.2.4.141Рис. 3.2.4. Открепление клеток линии 3Т3 с покрытия на основе поли(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)(85/15). А) Открепление клеток отпокрытия модифицированного ламинином; Б) Открепление клеток отпокрытия модифицированного коллагеном.Из графиков следует, что скорость открепления клеток ототносительно гидрофильного полимера (85/15) не зависит от типа белка,которыммодифицировнытермочувствительныепокрытия.Длясополимеров с мольным отношением N-ИПААм и N-трет-БААм (65/35) и(50/50) динамикаоткрепления зависит от типа фактора адгезии.Существенно, что для данных сополимеров факторы адгезии замедляютскорость открепления клеток за разумное время.
Например, через 100 минот сополимеров (65/35) и (50/50)покрытых коллагеном открепляетсялишь 60% клеток.Механизм открепления клеточных пластов связан с внутреннимимеханическиминапряжениями.Клеточныйслойнеотделяетсяодномоментно от подложки, а процесс отделения носит волнообразныйхарактер. Отделившаяся часть пласта начинает «заворачиваться», как этопоказано на рис. 3.2.5. В некоторых случаях пласт может сворачиваться142на себя.
(Последнее нежелательно, поскольку такой пласт невозможноиспользовать для дальнейшей работы.)На рис. 3.2.6приведеныпоследовательные снимки процесса открепления пласта клеток линии 3Т3от покрытия на основе поли-N-ИПААм, а на рис. 3.2.7 приведена сериямикрофотографии процесса открепления клеток 3Т3 от гидрогеляосновеполи-(N-ИПААм-со-ААБФ),центрифугирования с толщинойполученногопокрытия - 13 нм.наметодомВ обоих случаяхклетки инкубировали при 4 °С.
Сходная морфология открепившегосяклеточного пласта приведена на рис. 3.2.8, где показан пласт клеток 3Т3на сополимере поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ).Отметим,что, как правило,процесс открепления пластовпроисходит быстрее, чем процесс открепления одиночных клеток.Рис. 3.2.5. Схема открепления клеточного пласта. (а) Клетки образуютмонослой; (б) открепление, как правило, начинается на границеклеточного пласта; (в) сворачивание клеточного пласта.143Рис. 3.2.6. Открепление пласта клеток линии 3Т3 с покрытия на основеполи-N-ИПААм, полученного методом центрифугирования, толщинапокрытия - 100 нм. Время открепления пласта – 5 мин.
Шкала – 500мкм. Температура инкубации - 4 °С.144Рис. 3.2.7. Открепление пласта клеток линии 3Т3 с гидрогеля на основеполи-(N-ИПААм-со-ААБФ), полученного методом центрифугирования.Толщина покрытия - 13 нм. Время открепления пласта – 10 мин. Шкала– 500 мкм. Температура инкубации - 4 °С.145NE73Рис.
3.2.8. Открепление пласта клеток линии 3Т3 с покрытия наоснове поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ) (мол отношение 70/30), полученногометодом центрифугирования.Электронныемикрофотографиииллюстрируютпроцессоткрепления клеток 3Т3 с сополимера (85/15), покрытого коллагеном типаI.На фотографиях представлены как фазы открепления, так иморфологияклеточныхидентифицированыпластов.коллагеновыеНарис.3.2.9волокна.Клетки(А)вчеткопластахфибробластов сохраняют механическую связность, но при откреплении уклеток нарушаются межклеточные контакты.
На рис. 3.2.10 приведенымикрофотографии открепившегося клеточного пласта.146Рис. 3.3.9.Открепление клеток 3Т3с покрытия на основесополимера поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) (мол. отношение (85:15).Сканирующаяэлектроннаямикроскопия.А).Клеткидоначалаоткрепления. Б). Округлившиеся клетки после понижения температурыдо 4°С. В). Открепление пласта клеток.Рис.
3.2.10. Клеточный пласт после открепления. Клетки 3Т3 наколлагеновом матриксе. поли-(N-ИПААм-N-трет-БААм) (мол. отношение(85:15) А). Дорсальная сторона. Б). Вентральная сторона.147В случае эндотелиальных клеток (рис.3.3.11) клеточные контактысохраняются и при откреплении клеточного пласта.Рис. 3.3.11. Эндотелиальные клетки HUVEC. Поли-(N-ИПААм-со-Nтрет-БААм)(мол.
отношение (85:15) А). Монослой клеток дооткрепления. Б). Открепившиися пласт клеток.В заключение приведем фотографию, демонстрирующуюклеточный пласт в чашке Петри (рис.3.3.12).Рис. 3.3.12. Клеточный пласт в чашке Петри. Мезенхимальныестволовые клетки человека.1483.3 Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки человекана термочувствительных подложкахПрименение стволовых клеток – одно из основныхнаправленийсовременной регенеративной медицины. Одним из важнейших классовстволовыхклетокявляютсямультипотентныемезенхимальныестромальные клетки (МСК). Эти клетки способны к дифференцировке востеобласты (клетки костной ткани), хондроциты (хрящевые клетки) и вадипоциты (жировые клетки).
Соответственно МСК могут применяться впроцессах регенерации и восстановления соответствующих тканей иорганов. При реконструкции тканей и органов требуется значительноеколичество стволовых клеток, при этом наработка клеток должнасоответствовать технологическим и медицинским стандартам. Одно изограниченийналагаемыхстандартамисвязаносминимальнымприменением или отказом от продуктов животного происхождения приработе с культурами стволовых клеток.Под ограничения попадаютсыворотки для культивирования клеток, а также различные ферменты,такие как трипсин, коллагеназа и т.д.
Таким образом,развитие новых технологийнеобходимокультивирования и пассирования стволовыхклеток.Целью данной части работы являласьуправляемогокультивированиястромальных клеток человекаразработка методовмультипотентныхнамезенхимальныхпокрытиях на основеN-изопропилакриламида. В соответствии с целью исследования былиопределены следующие задачи:149- Провести фенотипический контроль стволовых клеток в процессекультвирования, открепления и последующего пассированияклеток;- Определить режимы дифференцировки мезенхимальныхстволовых клеток человека при культивировании их натермочувствительных полимерах.Прикультивированииклетокмыадгезионные факторы такие какнеиспользовалиспециальныефибронектин, коллаген, ламинин,поскольку, во-первых, МСК обладают значительным пролиферативнымпотенциалом, а, во-вторых, для работы с МСК рекомендуется применятьрекомбинантныефакторыростаиадгезииклеток(например,рекомбинантный фибронектин), что безусловно усложняет технологиюподготовки субстратов.
МСК были выделены из костного мозга взрослогоздорового человека (предоставлены(REMEDI), Ирландия).the Regenerative Medicine InstituteПри анализе фенотипа МСК и определениимаркеров дифференцировки мы придерживались рекомендаций комитетапомезенхимальным и тканевым стволовым клеткам международногообщества клеточной терапии ( Mesenchymal and Tissue Stem CellCommittee of the International Society for Cellular Therapy (ISCT)) (Dominici,et al, 2006). Возможное влияние полимеров и процедуры холодовогооткрепления напроцедураМСК исследовалось в экспериментах, в которыхбесферментногооткрепленияповторяласьтрижды.Эксперименты проводили на покрытиях из поли-N-ИПААм, полученныхметодом высушивания израствора.Толщина покрытий оцениваласьАСМ и составляла 1.07±0.07 мкм, шероховатость 16.01±0.90 нм, а краевойугол составлял 68.0±2.0 град.приведены на рис.
4.3.1.Сравнительные характеристики ростаВ культуре МСК образовывали монослой,процесс открепления клеток представлен на рис. 4.3.2. Клетки начинали150открепляться через 5 минут при понижении температуры. Полностьюпласт отходит от подложки за 30 мин.Метаболическаяактивность120ДНК% от контроля100806040200КонтрольПокрытиеРис. 4.3.1. Рост мезенхимальных стволовых клеток на покрытии изполи-N-ИПААм толщиной 1 мкм, полученных методом высушивания израствора.
Общее количество ДНК определяли по методу PicoGreen,метаболическую активность оценивали по методу Alamar Blue.Рис. 4.3.1. Открепление пластамезенхимальных стволовых клеток напокрытии из поли-N-ИПААм. Фотография (А)получена через 5 мин после охлажденияпласта. Фотография (Н) – через 18 мин.Шкала- 500 мкм.151Данные поэкспрессии маркеров МСКПозитивные маркеры,бесферментногоснятияпредставлены в таб.4.3.1.как в случае трипсинизации, так и в случаенаблюдалисьу95%болееклеток,чтосоответствовало установленным критериям для МСК. Для «негативных»маркеров установленным критерием является порог 2%. Этому критериютакже удовлетворяли клетки после бесферментного снятия клеток и послетрипсинизации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
