Диссертация (1097910), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Данные по экспрессии маркеров дифференцировки МСКсвидетельствуют, что фенотип МСК не меняется при пролонгированномкультивировании на термочувствительных материалах.Вследующейгруппеэкспериментовмыисследовалипроцессдифференцировки клеток в остеоциты, хондроциты и адипоциты.Таблица 4.3.1. Экспрессия маркеров после трипсинизации итрехкратного бесферментного снятия клеток на покрытиях из поли-NИПААм (1 мкм).МаркерCD19 (-)CD34 (-)CD45 (-)CD73 (+)CD90 (+)CD105 (+)Трипсинизация (%)0.9±0.11.1±0.40.8±0.196.0±1.595.6±0.998.0±1.2поли-N-ИПААм (%)0.7±0.21.5±0.41.0±0.295.5±1.295.2±1.198.8±1.0Дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стволовыхклеток человекаДифференцировкаклетоквостеоциты.Вэкспериментахподифференцировке использовались клетки трижды перепассированные натермочувствительных полимерах.Среда культивирования и процедураиндукции дифференцировки описаны в Главе «Материалы и методы».Здесь лишь укажем, что индукция дифференцировки вызывалась152специализированной средой культивирования, включающей в себягормоны, аскорбиновую кислоту и глицерофосфат.
Продолжительностькультивирования составляла 10-17 дней до достижения монослоя,«перерост» клеток в культуре не допускался. Степень дифференцировкиоценивали по двум критериям: общему количеству кальция в культуре иокраске монослоя клеток ализарином красным S. Результаты измерениякальция и соответствующие фотографии монослоев МСК и остеоцитовприведены на рис. 4.3.3Рис. 4.3.3. Дифференцировка МСК в остеоциты. Перед запускомдифференцировки клетки трижды пассировали на термочувствительномпокрытии. Окраска ализарином красным.
На правом графике по осиординат – концентрация кальция. 1) Недифференцированные клетки.Снятие трипсином. 2) Недифференцированные клетки. Поли-N-ИПААм.3) Дифференцировка на поли-N-ИПААм; 4) Дифференцировка. Снятиетрипсином.Дифференцировка клеток в адипоциты. Оценка степени дифференцировкиосновывалась на прокраске монослоев клеток красителем на липиды OilRed O. Результаты приведены на Рис.4.3.4.153Рис.
4.3.4. Дифференцировка МСК в адипоциты. Перед запускомдифференцировки клетки трижды пассировали на термочувствительномпокрытии. По оси ординат интенсивность поглощения красителя Oil RedO в изопропаноле. 1) Недифференцированные клетки. Поли-N-ИПААм. 2)Недифференцированные клетки. Снятие трипсином. 3) Дифференцировкана поли-N-ИПААм; 4) Дифференцировка. Снятие трипсином.Дифференцировка в хондроциты. Уровень дифференцировки оценивалипо количесту гликозоамингликанов нормированных на общее количествоДНК в клеточной популяции. Результаты измерений приведены нарис.4.3.5.РезультатыпокультивированиюМСКнатермочувствительныхполимерах, по управляемой дифференцировке МСК в остеоциты,адипоциты и хондроциты позволяют сделать вывод, чтоосновенемодифицированногополи-N-ИПААмиспользоваться при работе с МСК.154покрытия намогутуспешноРис. 4.3.5. Дифференцировка МСК в хондроциты.
Перед запускомдифференцировки клетки трижды пассировали на термочувствительномпокрытии. ND- не детектируется. По оси ординат нормированноеотношение гликозаминогликанов к общему количестку ДНК. 1) Недетектируется. Недифференцированные клетки. Поли-N-ИПААм. 2) Недетектируется. Недифференцированные клетки. Снятие трипсином. 3)Дифференцировка на поли-N-ИПААм; 4) Дифференцировка. Снятиетрипсином.155Выводы к главе 3Показано,чтогидрофильныесополимерынаосновеN-изопропилакриламида и этилпирролидонметакрилата поддерживаютрост клеток и обеспечивают бесферментное открепление клеток.Предложены методы улучшения цитосовместимости покрытий наоснове N-изопропилакриламида и N-трет-бутилакриламида путемувеличения содержания N-трет-бутилакриламида, а также примененияфакторов адгезии таких как коллаген, ламинин, фибронектин и поли-Lлизин.Впервые экспериментально показано, что наиболее значимыйполимер с нижней критической температурой растворимости (поли- Nизопропилакриламид) может быть успешно использован при работах скультурами клеток без какой-либо химической модификации.Впервые установлено, что рост клеток на термочувствительныхгидрогеляхнаакриламидобензофенонасубстратом,N-изопропилакриламидаосновековалентносвязанныхсиподлежащимзависит от толщины покрытий.
Показано, чтоисключительно ультратонкие покрытия толщиной порядка 10 нмобеспечивают рост клеток и бесферментное открепление клеток.Предложенныеметоды бесферментного открепления клетокапробированы на 12-ти типах клеточных культур. Установлено, чтоскорость бесферментного открепления клеток уменьшается с ростомгидрофобности покрытий,факторы адгезии клеток специфичноуменьшают скорость открепления клеток.При пролонгированном культивировании на подложке из Nизопропилакриламида мезенхимальные стволовые клетки человека неменяютсвойМезенхимальныефенотипистволовыесохраняютклетки,156плюропотентность.культивируемыенатермочувствительном покрытии,хондроцитыиостеоцитыдифференцируются в адипоциты,придифференцировки.157соответствующейиндукцииГЛАВА 4Термочувствительные полимеры для доставки лекарствВведениеЛокальные системы доставки лекарств с циклической кинетикой приняторазделять на два класса (Kikuchi and Okano, 2002): системы с заданнойкинетикой выхода лекарства (Intra et al., 2008; Kashyap et al., 2007; Liu etal., 2007; Makino et al., 2000)и системы, способные реагировать наизменения внешних условий (Li and D’Emanuele, 2001; Mohamad andDashevsky, 2006; Satarkar and Hilt, 2008; Schellekens et al., 2008).
Стимул –зависимые системы могут реагировать на изменение температуры, наэлектромагнитные сигналы и на различные химические и биохимическиевоздействия.К таким системам относятся устройства на основеполимеров с НКТР.кинетикувыходаМатериалы с НКТР позволяют резко изменятьлекарстваприотносительнонезначительномуменьшении температуры. Схема, приведенная на рис.
2, в общих чертахсправедлива для всех устройств на основе полимеров с НКТР, хотяфизические реализации могут быть самыми различными.В последние годы было опубликованонемало работ, в которыхпредлагались различные системы доставки лекарств, основанные наприменении полимеров с НКТР. Среди них системы основанные наприменении гидрогелей(Caykara et al., 2006; Coughlan et al., 2004),микросфер (Fundueanu et al., 2009b; Mundargi et al., 2010; Wei et al., 2009),термочувствительных мембран(Li and D’Emanuele, 2001)и тонкихпленок (Doorty et al., 2003; Kavanagh et al., 2005).
В большинстве работкинетикавыходалекарствасоответствоваладиффузионной,авмембранной системе, как можно и ожидать, наблюдалась кинетиканулевого порядка (zero-order release) (Fundueanu et al., 2009b). Скорость158выходалекарстввтакихсистемахможноизменятьварьируяконцентрацию лекарства, геометрические параметры системы, а такжепродолжительность «открытого» состояния системы. Продолжительностьодного цикла, в течение которого температура опускалась нижекритическойи наблюдался выход лекарства варьировала от 20 мин(Fundueanu et al., 2009b) до 15 ч (Coughlan et al., 2004).Разработаннаянамитермочувствительныхсистематонких гелейдоставкилекарствизна основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ) также характеризуется двумя режимами: набуханием и высокойгидрофильностьюпритемпературахнижеНКТР,атакжеколлапсированным состоянием с относительно высокой гидрофобностьюпри температурах выше НКТР.Для описания процессов доставки лекарств из термочувствительныхпокрытий нами была предложена математическая модель, котораяописывает диффузию лекарства из термочувствительных покрытий приизменяющихся температурных режимах.
Математические модели длядоставки лекарств из гидрогелей были предложены ранее вработах:(Brazel and Peppas, 2000; Crank, 1975; Fujita, 1961; Grassi and Grassi, 2005;Kikuchi and Okano, 2002; Lee, 1985; Siegel and Pitt, 1995; Siepmann et al.,1998; Siepmann and Siepmann, 2008), известны также математическиемодели, описывающие диффузию лекарств из тонких пленок (Cooke andChen, 1995; McCaig et al., 2000; Sanches Silva and Cruz, 2007; Wang et al.,2007).
Модель, предложенная в нашей работе, описывает как процессыпереноса в гидрофильных набухших матрицах, так и процессы диффузиив гидрофобных сколлапсированных пленках.В работах, посвященныхдоставке лекарств из полимеров с НКТР,температурный контроль осуществлялся принудительным изменением159температуры водного окружения (применялись термостаты, проточныесистемы, термостолы и т.д.). В настоящее время не существует устройствпозволяющих локально понижать температуру собственнно полимерногоматериаласНКТРилиносителя,накоторомэтотполимериммобилизован.Теоретически возможны несколько физико-химических механизмов,позволяющихлокальнопонижатьтемпературуносителятермочувствительного полимера.
Один из очевидных подходов связан сосуществлением эндотермической реакции, для протекания которойнеобходимо дополнительная энергия. Классическая реакция растворенияаммония нитрата в воде в концентрации 1М может понизить температуруна 6 0С, что может быть достаточно для структурного перехода полимеровс НКТР.
В настоящее время уже существуют медицинские изделия,основанные на эндотермических реакциях, способные быстро охлаждатьорганы и ткани человека при травмах.механизмлокальногопониженияЕще один потенциальныйтемпературысвязансмагнитокалорическим эффектом. В этом случае приложенное магнитноеполе может вызывать локальное снижение температуры в специальныхсплавах, даже при физиологической температуре (Campos et al., 2006),что, в свою очередь,лекарством.можетпонижать температуру полимера сВ нашей работе мы предложили использоватьмеханизмлокального охлаждения, основанный на применении элемента Пельтье.1604.1 Исследование кинетики выхода лекарств изтермочувствительных покрытийВданнойглавебылииспользованысополимерыN-изопропилакриламида и акриламидобензофенона . Метод полученияпокрытий при помощи фотореакции описан нами ранее (Nash et al.,2011;Yang et al., 2013).Покрытия готовили методом высушивания израствора.
Схема эксперимента и измерительная ячейка приведены в главе«Экспериментальные методы».использоватьсядостаточнойдлядоставкиемкостьюрассматриваемыхДля того, чтобы покрытия моглилекарств,(объемом).пленкиХарактернаядолжныобладатьтолщинапленок– 5 мкм. (Это на порядки большев данной главетолщин фотосшитых пленок, которые использовались при работе склеточными культурами.) Заметим, что покрытия с толщиной порядка 1100 мкмактивно используются в медицинских изделиях для локальнойдоставки лекарств, например, в кардиоваскулярных стентах (Ranade et al.,2004).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
