Диссертация (1097910), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Рост клеток линии HeLa на сополимерах поли-(N-ИПААм-со-Nтрет-БААм). 1) поли-N-ИПААм; 2) Сополимер:85/15;3) Сополимер:65/35;4) Сополимер:50/50;5) ПСКК. (Пределы погрешностейсоответствуют стандартному отклонению, n=3.)117Для объяснения механизмов адгезии и роста клеток нами былаисследованаэкспрессиягеновHeLaклетокнагомологичныхтермочувствительных покрытиях в сравнении с ПСКК. Используя техникуДНК-чипов, были определены гены, экспрессия которыхотличнав клеткахна всех покрытиях поли-(N-ИПААм-N-трет-БААм)посравнению с контролем (рис.3.1.4 (в)).
В списке детектированных геновможно выделить гены, непосредственносвязанные с внеклеточнымматриксом (фибронектин и тромбоспондин-1), с организацией цитоскелета(САР-1, α-актин), с митогенами (Smad6), с генами, контролирующимицитокины (ADAM17) и др. Экспрессия фибронектина в клетках, растущихна сополимерах, ниже, чем в контроле (уменьшение в -2.3-, 2.0-, и 2.6- разадлясополимеров50:50,65:35,85:15соответственно).тромбоспондина, гликопротеина внеклеточного матрикса,Дляуровеньэкспрессии снижен в 3.7, 5.4, 6.5 раза соответственно.
Резкое увеличениеэкспрессии гена DUSP2 (3.9, 14.6 и 17.0) связано в данном случаесорганизацией цитоскелета, как показано в более поздних работах Allen etal., 2006; SEFCIK et al, 2013.Для клеток, растущих на полимерах,наблюдается уменьшение экспрессии генов, связанных с организациеймикрофиламентов (TUBB4, TUBB, TUBA1 и α-актин), а также снижениеэкспрессии гена CAP-1, связанного с внутриклеточной концентрациейцАМФ и организацией микрофиламентов (в 1.8, в 1.8 и в 2.0 разасоответственно) .
Анализ экспрессии генов указывает как минимум на двесистемы, которые вовлечены в процесс прикрепления и распластыванияклеток, на внеклеточный матрикс и клеточный цитоскелет. Общая схемарегуляции клеточной адгезии, включающая вклады отдельных белков,сложна и недостаточно изучена, поэтомуцелесообразнооценитьинтегральный параметр, характеризующий взаимодействие клеток стермочувствительнымипокрытиями.118Площадьклеток,взаимодействующих с подложками, была определена с использованиемсистемы анализа изображений (рис.3.1.4. (а,б)). Средняя площадь клетокв контроле значительно превышала площадь клеток на сополимерах, приэтом с увеличением содержания поли-N-ИПААм площадь клетокуменьшалась.Заметим,чтосувеличениемсодержаниягидрофобного мономера растет и скорость роста клеток.болееДанныйрезультат не может быть объяснен в рамках концепции «оптимальнойсмачиваемости» субстрата, т.к.увеличение содержания N-трет-БААм,делает систему более гидрофобной и «отдаляет» от зоны оптимальныхкраевых углов для клеточной адгезии.
Организация цитоскелета клеток вконтроле и на покрытиях также была различна ((рис.3.1.4 (г)).Причинаподобного поведения клеток была отчасти объяснена в работе Allen et al,2006, где авторами на этой же группе полимеров поли-(N-ИПААм-со-Nтрет-БААм) было показано, что сорбция фибронектина – важнейшегофактора клеточной адгезии на поверхности сополимеров была меньше,чем в ПСКК, и уменьшаласьс ростом содержания поли-N-ИПААм.Таким образом, можно предложить следующую схему взаимодействияклетокитермочувствительныхполимеров.Фибронектин,присутствующий в среде культивирования, недостаточно адсорбируетсяна термочувствительные поверхности, чтоне позволяет клеткамраспластаться, реорганизовать цитоскелет и войти в клеточный цикл.Поскольку в таких клеткахвнеклеточного матрикса, тоснижен уровень синтеза элементовпроцесс распластывания клеток еще болеезамедляется.119Рис.3.1.4.
Клетки HeLa на термочувствительных покрытиях на основеполи-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм).24 ч культивирования. а)Относительная площадь клеток на сополимерах по отношению кплощади клеток на ПСКК. Величина ошибки соответствуетстандартной ошибке измерения. В скобках приведено количествоизмеренных клеток. Использованы следующие значения длядоверительных интервалов: *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.005 присравнении площадей клеток на ПСКК и сополимерах по критериюСтьюдента .Обозначения (●) и (●●●) соответствуют значениям P<0.05и P<0.005 при сравнении площадей клеток на различных сополимерах.
б)Распластывание клеток на различных сополимерах. Клетки на сополимере85/15 при дальнейшем культвировании приобретают морфологиюсходную с клетками на других сополимерах. Шкала – 50 мкм. в)Экспрессия генов клеток HeLa, растущих на различных сополимерах. г.Флюоресцентная микроскопия.
Актиновые филаменты фиксированныхклеток окрашены родамин-фаллоидином.120Рост клеток на микронных покрытиях, модифицированных факторамиадгезии.Поскольку гидрофобные полимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-N-третБААм) не обеспечивают достаточную адсорбцию белковых факторовадгезии из сыворотки, что в свою очередь приводит к недостаточнойадгезииклеток,необходимотермочувствительныхбылопокрытиймодифицироватьфакторамиповерхностьадгезии.Мыпроанализировали эффект фибронектина, коллагена типа I, ламинина I иполи-L-лизина на рост клеток линии 3T3и первичных эндотелиальныхклеток человека HUVEC.На рис 3.1.5.
приведены микрофотографии, характеризующие ростклеток 3Т3 на сополимерах поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм). На всехтрех сополимерах наблюдается адгезия и распластывание единичныхклеток.Нанесение факторов факторов адгезии на термочувствительныепокрытия увеличивало распластывание клеток (рис.3.1.6) и ускоряло ихрост (рис.3.1.7).Рост клеток оценивали по интегральному количествуДНК в популяции (метод PicoGreen), а также по метаболическойактивности клеток (метод AlamarBlue).Сходные результаты былиполучены для первичных клеток HUVEC (рис.3.1.9 - рис.3.1.11).Специально отметим, что как для клеток 3Т3, так и для клеток HUVECнаблюдался низкий уровень метаболической активности клеточныхкультур на покрытиях из термочувствительных сополимеров.Нанесение факторов факторов адгезии на термочувствительныепокрытия увеличивало распластывание клеток (рис.3.1.6) и ускоряло ихрост (рис.3.1.7).121Рис.
3.1.5. Клетки линии 3T3 на (a) ПСКК, (б) на сополимере поли-(NИПААм-со-N-трет-БААм) ( мол. отношение 85:15), (в) сополимере65:35 и (г) сополимере 50:50. 24 ч культивирования. Толщина покрытий5 мкм. Шкала- 130 мкм.Рост клеток оценивали по интегральному количеству ДНК в популяции(метод PicoGreen), а также по метаболической активности клеток (методAlamarBlue). Сходные результаты были получены для первичных клетокHUVEC (рис.3.1.9 - рис.3.1.11). Специально отметим, что как для клеток3Т3, так и для клеток HUVEC наблюдался низкий уровень метаболической122активности клеточных культур на покрытиях из термочувствительныхсополимеров.Наши данные свидетельствуют о том, что нанесениеФАзначительно улучшает рост клеток, но для каждого типа клеток и типаполимера необходимо подбирать оптимальный ФА.
Так , для первичныхклетокэндотелияHUVEC,культвируемыхнасополимере85/15,оптимальным оказываются ФА ламинин и коллаген. А для клеток 3Т3 –лучшие показатели роста клеток получены на сополимере 65/35 для этихже ФА. Методом АСМ нами было показано, что ламинин и фибронектиноднородно покрывают термочувствительные полимеры (рис.2.2.4.3 ирис.2.2.4.4) , в то время как коллаген образовывал фибриллярныеотносительно неоднородные структуры (рис.2.2.4.1).
Тем не менее, во всехуказанных случаях наблюдалось равномерное распределение клеток поповерхности культивирования. Поли-L-лизин, по-видимому, не во всехслучаях образует однородное покрытие полимеров.клетки HUVEC не образовывают монослоя,На рис. 3.1.12 (а)что свидетельствует онеоднородном покрытии сополимера 85/15 поли-L-лизином. Вместе с тем,насополимере50/50,покрытомполи-L-лизиномнаблюдалосьравномерное распределение клеток на поверхности покрытия. Ростовыехарактеристики поли-L-лизина уступали аналогичным в случае клеток 3Т3(рис.
3.1.8.).123Рис. 3.1.7. Клетки линии 3Т3 на термочувствительных покрытиях наоснове сополимеров поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм )модифицированных ламинином I и коллагеном типа I . (a) коллаген насополимере 85:15, (б) ламинин на сополимере 85:15, (в) коллаген насополимере 65:35, (г) ламинин на сополимере 65:35, (д) коллаген насополимере 50:50 и (е) ламинин на сополимере 50:50. Культивирование24 часа. Шкала 130 мкм.124Рис. 3.1.8. Рост клеток 3Т3 на термочувствительных покрытиях изполи-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм), модифицированных факторамиадгезии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
