Диссертация (1097910), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Группа столбцов (PS control) - ПСКК, ПСКК покрытыеколлагеном типа I, ламинином I и поли-L-лизином соответственно.Группы столбцов 85:15, 65:35 и 50:50 – покрытия на основесоответствующих сополимеров без покрытия, а также покрытыхколлагеном типа I, ламинином I и поли-L-лизином. Толщина покрытия –4 мкм. а) Метаболическая активность (Alamar Blue); б) Количество ДНКв клеточной популяции. (Метод PicoGreen).125Рис. 3.1.9. Первичные клетки линии HUVEC культивируемые напокрытиях из поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм). (a) ПСКК, (б) сополимер85:15, (в) сополимер 65:35 и (г) сополимер 50:50.Продолжительностькультивирования 24 ч. Толщина покрытия - 4 мкм.
Шкала: (a) – (в) 130мкм, (г) 60 мкм.126(a)(б)(в)(г)(д)(е)Рис.3.1.10. Первичные эндотелиальные клетки человека линии HUVEC натермочувствительных покрытиях на основе сополимеров поли-(NИПААм-со-N-трет-БААм ) модифицированных ламинином I и коллагеномтипа I . (a) коллаген на сополимере 85:15, (б) ламинин на сополимере85:15, (в) коллаген на сополимере 65:35, (г) ламинин на сополимере 65:35,(д) коллаген на сополимере 50:50 и (е) ламинин на сополимере 50:50.Культивирование 24 часа.
Шкала 130 мкм (б) и (г); 60 мкм (а,в,д, е).127Рис. 3.1.11. Рост первичных эндотелиальных клеток человека HUVECна термочувствительных пленках покрытых факторами адгезии.Термочувствительное покрытие на основе поли-(N-ИПААм-со-N-третБААм). Соотношение мономеров: 85/15.
Толщина покрытия – 4 мкм. А)Общееколичество ДНК (Метод PicoGreen). Б) Метаболическаяактивность (Alamar Blue.)128Рис. .1.12. Клетки HUVEC на сополимерах поли-(N-ИПААм-со-N-третБААм), покрытых поли-L-лизином. (a) сополимер 85:15, (б) сополимер50:50. 24 ч культивирования. Отсутствие монослоя (а)свидетельствует о неравномерном покрытии поли-L-лизином. (Шкала- 60 мкм).Рост клеток на ультратонких покрытиях, полученных методомцентрифугированияНами было исследовано три типа покрытий, полученных методомцентрифугирования.- Покрытия на основе поли-N-ИПААм- Гидрогели на основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ)- Покрытия на основе гидрофильных сополимеров поли-(N-ИПААмсо-ЕПМ)129Покрытия на основе поли-N-ИПААмНаиболее детально были изучены материалы на основе поли-N-ИПААм,поскольку именно N-ИПААмявляется ключевым мономеромприполучении покрытий.
Кроме того, это наиболее исследованный ираспространенный полимер с НКТР.Нами было показано, что краевой угол для пленок из поли-N-ИПААм,полученных методом центрифугирования, составляет приблизительно 50град. Можно предположить, что такое покрытие будет поддерживать ростклеток. Действительно, покрытие толщиной 100 нм из поли-N-ИПААм,полученноеметодомцентрифугирования,значительнолучшеобеспечивает рост клеток, чем такое же покрытия, полученные методомвысушивания из раствора.
На рис.3.1.13 приведены фотографии культурклеток 3Т3, растущих на покрытиях из поли-N-ИПААм, полученных какметодом высушивания из раствора (рис.3.1.13 (в)) , так иметодомцентрифугирования (рис.3.1.13 (б)) .Очевидно, что рост клеток напокрытиях полученных методом центрифугирования сопостовим с ростомклеток на ПСКК (рис.3.1.13 (а)), что подтверждается данными поколичеству клеток и их метаболической активности (рис.3.1.14 (а)).Методом центрифугирования были получены покрытия в диапазонетолщин 2нм-2 мкм. Рост клеток на покрытиях, полученных методомцентрифугирования, не зависел от толщины покрытия (рис.3.1.14 (б)) ипрактическизависимостисовпадал с ростом на ПСКК.ростаценирифугирования,клетокотскоростиБыли исследованыипродолжительностиа также от концентрации поли-N-ИПААм (рис.3.1.15).130Из этих данных следует, что в широкомцентрифугирования, покрытиядиапазоне параметровиз поли-N-ИПААм поддерживают ростклеток.Рис 3.1.13.
Клетки линии 3Т3 на термочувствительных покрытиях наоснове гомополимера поли-N-ИПААм. 24 часа культивирования. (а)ПСКК; (б) Покрытие нанесено методом центрифугирования. Толщина100 нм; (в) Покрытие получено высушиванием из раствора. Толшинапокрытия – 4 мкм.131Рис. 3.1.14. Клетки 3Т3 на покрытиях их поли-N-ИПААм. А) Сравнениероста клеток на покрытиях, полученных методом центрифугирования(толщина - 100 нм) и методом высушивания из раствора (толщина –4мкм); Б) Рост клеток 3Т3 на покрытиях, полученных методомцентрифугирования.
(Пределы погрешностей соответствуютстандартному отклонению, n=3.)Рис. 3.1.15. Рост клеток линии 3Т3 на покрытиях из гомополимераполи-N-ИПААм. 24 часа культивирования. (а) Зависимость роста клетокот скорости центрифугирования. (б) Зависимость роста клеток отконцентрации поли-N-ИПААм. (в) Зависимость роста клеток отвремени центрифугирования. (Пределы погрешностей соответствуютстандартному отклонению, n=3.)132Покрытия на основе поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ)Сравнительные характеристики роста клеток линии 3Т3 на сополимерахполи-(N-ИПААм-со-ЕПМ)приведены на рис. 4.1.16..Для всехсополимеров общее количество ДНК в популяции было статистическидостоверно больше, чем в контроле (P<0.05).
Метаболическая активностьна сополимерах не отличалась от контрольной, но была достоверно нижена гомополимере (P<0.05).Рост клеток на поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ)может быть объяснен тем, что краевые углы для сополимеров находятся вдиапазоне20-500С,т.е.вдиапазонеугловхарактерномдляцитосовместимых поверхностей.Рис.3.1.16. Рост клеток 3Т3 на покрытиях из поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ).24 ч культивирования. Зависимость роста клеток 3Т3 от содержанияполи-N-ИПААм. (Пределы погрешностей соответствуютстандартному отклонению, n=3.)133Следующимклассомтермочувствительныхполимеровбылифотосшитые полимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ).
Результаты,приведенные на рис. 4.1.17указывают на зависимость роста клеток оттолщины покрытия, при этом рост на ультратонком покрытии неотличается от роста в контроле (рис.4.1.18).Явлениезависимостиростаклетокоттолщинытермочувствительных покрытий хорошо известно для графт-полимеровна основе поли-N-ИПААм (Akiyama et al, 2004; Fukumori et al, 2010). Так вработе Akiyama et al, 2004, показано, что эндотелиальные клетки артериикоровуспешнорослинапокрытияхтолщиной15нминедемонстрировали нормального роста при толщинах в 29 нм.
Авторы неприводят объяснения данного феномена , но связывают зависимость ростаклеток от толщины покрытия различной гидратируемостью ультратонкихпленок. Еще одним возможным механизмом эффекта толщины покрытияявляетсяспособностьбелков,ответственныхзаадгезиюклеток,сорбироваться на подлежащий субстрат (Halperin and Kröger, 2012). Впользу данной гипотезы говорит наличие зависимости роста клеток отплотности графт-покрытия. При плотности вышепороговой белки наадгезируют на подлежащий субстрат и не поддерживают адгезию клеток.134Рис.4.1.17. Зависимость роста клеток на фотосшитых полимерах наоснове поли-(N-ИПААм-со-ААБФ) в зависимости от толщины покрытия.Сравнение по общему количеству ДНК (метод PicoGreen).Рис.4.1.18.
Рост клеток 3Т3. 24 ч культивирования. (а) ПСКК; (б)Покрытие на основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ), толщина 13нм.1353.2 Бесферментное открепление клеток от термочувствительныхпокрытийПроцессы открепления клеток в культуре от субстратов до последнеговремени не привлекали к себе внимания. Лишь в последние годыпоявились публикации, в которых исследуются структурные и клеточныеаспектыоткрепленияклеток(Cooperstein, Canavan, 2010;оттермочувствительныхHalperin andсубстратовKröger, 2012).В этихпубликациях авторы рассматривают процессы открепления клеток иклеточных пластов от термочувствительных покрытий, полученныхисключительнометодом графт-полимеризацииMatsuda et al., 2007).
При этом в настоящее времянекоторые(Okano et al., 1995;установлены лишьэмпирические закономерности открепления клеток оттермочувствительных покрытий (см., например, Okano et al., 1995).В нашем случае мы располагаем серией термочувствительныхпокрытий, что дает возможность исследовать закономерности открепленияклеток, связанные с изменением композиции полимеров. Целью даннойчасти работы является установление закономерностей открепления клетоки клеточных пластов от термочувствительных субстратов. В соответствиис целью исследования были определены следующие задачи:- Исследование динамики открепления единичных клеток иклеточных пластов- Выявление связи структуры полимеров и характеристикбесферментного открепления клеток- Влияние факторов клеточной адгезии на динамику открепленияклеток и клеточных пластов.136При анализе процессов открепления клеток от термочувствительныхсубстратов целесообразно разделять открепление изолированных друг отдруга клеток и клеточных пластов.
В пластах, клетки, взаимодействуядруг с другом,поддерживают структурнуюслоев. Откреплениецелостность клеточныхклеточных пластов как целого отличается ототкрепления единичных клеток.Здесь уместнопривести аналогию спроцессами морфогенеза, где движение пластов связано с внутреннимимеханическиминапряжениями,ивозникающейприэтомнеустойчивостью, а движение отдельных клеток - с системой клеточнойлокомоции и потерей межклеточных контактов (Белоусов, 2005 ;Белинцев, 1991).Процесс открепления отдельных клетокс тонких покрытий(толщина 100 нм) на основе поли-(N-ИПААм) исследовался методомцейтраферной микросъемки. Серия обзорных фотографий процессаоткрепления клеток линии 3Т3 приведенана рис.
3.2.1. Откреплениеклеток от субстрата неизменно сопровождается разрушением цитоскелетаи осфериванием. Нарисунке 3.2.2представлены серии фотографийоткрепления одиночного фибробласта линии 3Т3, а также приведенадинамика изменения диаметра клетки.На рис.3.2.3приведенымикрофотографии пары взаимодействующих клеток. Очевидно, чтонаряду с силами адгезии субстрат–клетка, существенную рольиграют межклеточные взаимодействия.137здесьРис.3.2.1.Откреплениефибробластовлинии3Т3стермочувствительного покрытия на основе поли-(N-ИПААм)припонижении температуры до 4 °С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
