Диссертация (1097910), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Набухание сополимеров поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) вводе, 37о, 24 часа. Толщина покрытий составляет 10 мкм.Таким образом, покрытия на основе поли-(N-ИПААм-N-трет-БААм)характеризуютсяотносительно низкой поверхностной энергией ивысокими краевыми углами по сравнению с материалами традиционноиспользуемыми для культур клеток (стекло, ПСКК, Thermanox и т.д.). Сдругой стороны, поверхностный слой термочувствительных покрытий неявляется стабильным, о чем свидетельствуют как сорбция воды так имеханические деформации (явление “stickand slip”). При этом болеегидрофобные покрытия обладают большей стабильностью.1002.2.4.
Термочувствительные покрытия, модифицированныефакторами адгезииОднимизтрадиционныхметодовулучшенияцитосовместимостибиоматериалов является нанесение на их поверхность факторов адгезииклеток. Нами были получены и проанализированы покрытия из коллагенатипаI,ламининатермочувствительныеIифибронектина,поверхности.характеризовали методом АСМ.которыенаносилисьМодифицированныенапокрытияНа рис. 2.2.4.1, полученным методомАСМ, показаны неупорядоченные фибрилы коллагена на сополимереполи-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) (85:15). Нативность тройной спиралисохранялась, что подтверждает наличие периодической структуры спериодом67нм(рис.2.2.4.2).Некоторыетопографическиехарактеристики покрытий, модифицированных коллагеном, приведены втаб.2.2.4.1.Из данных следует, что топография коллагновых покрытийне зависит от типа характеристик подлежащего термочувствительногосубстрата.101Рис.
2.2.4.1. Коллаген типа I на сополимере из поли-(N-ИПААм-со-Nтрет-БААм) (молярное отношение 85/15).Рис. 2.2.4.2. Периодическая структура коллагена. Период- 67 нм.Сополимер поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) (молярное отношение85/15).102Рис. 2.2.4.3. Ламинин I на сополимере из поли-(N-ИПААм-со-N-третБААм) (молярное отношение 85/15). Выделены субъединицы молекулыламинина.Таблица 3.3.2.
Характеристики термочувствительных пленок, покрытыхколлагеном типа I.50:50ЗонаСканирования 25 x 2565:3585:1510025 x100x10025x10025 x 25100x100(мкм х мкм)RMS41.640.745.468.35186.7Ra33.529.634.950.44067.6Rmax329451533748396679Покрытия из ламинина, характеризовались глобулярной структурой(рис.2.2.4.3 ), характеррной для нативной струтуры молекулы ламинина.Покрытия на основе фибронектина были наиболее гомогенны (рис.2.2.4.4), что соответствует данным по шероховатости покрытий,модифицированных белками (Рис. 2.2.4.5).103Рис. 2.2.4.4. А) Фибронектин на сополимере из поли-(N-ИПААм-N-третБААм) (молярное отношение 85/15).
Б) 3-D изображение.Рис. 2.2.4.5. Шероховатость (RMS) покрытий из коллагена I, ламинина Iи фибронектина.104Выводы к главе 2Былиполученытермочувствительныеповерхностисмалойшероховатостью (RMS<30 нм), заданной толщиной в диапазоне 10 нм 104 нм и обладающие модулем Юнга 3-5 ГПа. Впервые охарактеризованыпокрытия на основе N-изопропилакриламида и N-трет-бутилакриламидас различными молярными соотношениями мономеров и с нижнейкритической температуройПоказано,чторастворимости в диапазонеувеличениесодержаниямономерасополимере поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)9°С - 32°С.N-трет-БААмвведет к уменьшениюНКТР и к увеличению краевого угла натекания, который характеризуетсянестабильным поведением (явление «Stick and slip”). Впервые получен иохарактеризован новый класс гидрофильных сополимеров на основе Nизопропилакриламидаиэтилпирролидонметакрилатаснижнейкритической температурой растворимости в диапазоне 33°С - 36°С.Впервые установлено, что применение метода центрифугирования длянанесенияпокрытийпозволяетполучатьтермочувствительныеповерхности на основе N-изопропилакриламида с краевым углом50 град.натекания близким ктермочувствительныеультратонкиеПолучены и охарактризованыгидрогелинаосновеN-изопропилакриламида и акриламидобензофенона, ковалентно связанные сподлежащим субстратом.105ГЛАВА 3Взаимодействие термочувствительных покрытий и клетокВведениеНастоящая глава посвящена взаимодействиюклеточных культуртермочувствительными покрытиями.
Анализ такогосвзаимодействиявключает в себя два этапа. Прежде всего, необходимо было установитьосновныезакономерностиповерхностях,ростаклетокнатермочувствительныхпосле чего исследовать процессы бесферментногооткрепления клеток. Этим проблемам посвящены первые два параграфаданной главы. В отдельном параграферассматривается поведение МСКчеловека на термочувствительных покрытиях. В экспериментах по ростуи бесферментному откреплению клеток нами было исследовано поведение12-ти типов первичных клеток и перевиваемых клеточных линий, ноанализ поведения мезенхимальных стволовых клетокчеловека мывыделили в отдельный параграф, поскольку именно этот тип клеток насегодняшний день является наиболее перспективным для использованияв регенеративной медицине, тканевой инженерии и клеточной терапии.Основныеметоды исследования клеток и клеточных популяции,применяемых в данной работе, приведены в таб.3.1.Прежде чем перейти к разделу «Результаты»,необходимо датькраткий обзор традиционной техники открепления клеточныхкультурот подложек, а также указать на те ограничения, которые связаны сприменением протеолитических ферментов при работе с клеточнымикультурами.106Таб.3.1.
Характеристики клеток и клеточных популяций и методы ихисследования.Экспериментальный методПроточная цитометрияХарактеристики клеток иклеточных популяцийМаркеры стволовых клетокПЦРДНК чипыЭкспрессия геновСравнительная экспрессия геновклеток, культивируемых натермочувствительных субстратахОбщее количество ДНК в популяции Количество клеток в популяции( метод PicoGreen)REDOX индикаторМетаболическая активность клеток(метод AlamarBlue)Электронная микроскопияМорфология клеточных пластовМорфометрияОценка площади распластанныхклетокЦитохимия, иммунохимияОпределение дифференцировкистволовых клеток ; идентификациямаркеров эндотелиальных клеток;Цейтраферная съемкаДинамика открепления клеток иклеточных слоевТрадиционные методы открепления клетокВыделяют два основных метода отделения клеток от субстрата:энзиматический, основанный на применении протеолитических ферментови механический, при котором клетки удаляются с подложки соскобом.Существует целый ряд ферментов, разрушаюших взаимодействиебелковых комплексов, поддерживаюших взаимодействие клетка-субстрат.Основные ферменты, используемые при работе с клеточными культурамиприведены на рис.
3.1.107Рис.3.1. Ферменты применяемые для работы с субстрат-зависимымикультурами клеток(http://www.worthingtonbiochem.com/CIT/CIT_Product%20Insert_2012.pdf).Наиболее распространенным энзимом, используемым при работе склеточными культурами является трипсин, который, как следует издиаграммы на рис. 3.1, является и наиболее «сильным» ферментом.Типичные микрофотография клеточной культуры после трипсинизацииприведена на рис. 3.2.Трипсин - сериновая протеаза, катализирующая гидролиз белков ипептидов.
Первое упоминание трипсина для работы с клетками дано вработе (Rous and Jones, 1916), а современные протоколы использованиятрипсина для работы с клеточными культурами ведут свое начало от работс клетками линии HeLa (Scherer et al., 1953). Механизм действия трипсина108основывается на взаимодействии аспартата в каталитическом центре сположительно заряженными лизином или аргинином белка-субстрата.Рис.3.2. Открепление клеток млекопитающих в процессе трипсинизации.На левой фотографии – монослой клеток.
На правой фотографии –суспензия клеток после трипсинизации.Если трипсин (как и папаин), взаимодействуя с комплексами рецепторлиганд,можетрецепторами,тонепосредственнотакиевзамодействоватьферментыкаксколлагеназаклеточнымииэластазавзаимодействуют с внеклеточным матриксом, что также может приводитьк откреплению клеток. (Разумеется, в том случае если данный типвнеклеточного матрикса присутствует в культуре).Трипсинизация клеток во многих случаях приводит к изменениюклеточного фенотипа, повреждению и гибели клеток.
Так в работе Huanget., 2010, показано, чтотрипсинизация проводит к комплексномуизменению экспрессии генов. Наряду с уменьшением экспрессии геновответственных за клеточный ростувеличиваетсяответсвенных, например, за апоптоз. Вэкспрессия генов,ранних работах исследовалисьболее частные проявления трипсинизации. Так в работе Waymouth, 1974,показано, что трипсин может влиять на клеточную дифференцировку,109Reiners et al., 2000, утверждает, что применение трипсина приводит куменьшению внутриклеточного глютатиона, а в работе Miller , McGee,2002, показано, что трипсин влияет на синтез эндотелиальными клеткамитакого важного медиатора как интерлейкин-6.
Принципиальным являетсято обстоятельство, что в ходе трипсинизации разрушаются межклеточныеконтакты, а следовательно, нарушается целостность клеточного монослоя.После трипсинизации невозможно использовать пласт клеток, например, втканевой инженерии для реконструкции тканей и органов (Yamato andOkano, 2004; Owaki at al., 2014; Satyam at al., 2014). Отметим, что напрактике проблемы связанные с трипсином хорошо известны всем, ктозанимался культурами клеток. Увеличение времени экспозиции клеток врастворетрипсина,использованиетрипсинавнеоптимальнойконцентрации зачастую просто приводят к гибели клеток.Механическое удаление клеток с поверхности даже при помощиспециальных эластичных материалов также может приводить к гибеликлеток вследствие разрушения клеточных мембран (Fujioka et., 2003).Проблемы, связанные с нативностью клеток при их откреплении,инициировали развитие новых методов разделения клеток и субстрата.Один из методов, например,основан на применении ультразвука ,который, вызывая кавитацию, может инициировать открепление клеток отподложки (Ohl and Wolfrum, 2003; Lu and Zhong, 2005).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
