Диссертация (1097910), страница 7
Текст из файла (страница 7)
МСК человека были выделены изкостного мозга (предоставлены(REMEDI), Ирландия).the Regenerative Medicine InstituteКлетки культивировали в среде DMEMприсутствии 10% эмбриональной сывороткивкоров и добавлениемростового фактора FGF-2. Использовались клетки 2-го-5-гопассажей.Клетки высевались в концентрации 20,000 cells/cm2 и использовались вэксперименте на 5 день. Для положительного контроля МСК смешивалсьв культуре с 10 % (от общей численности популяции) CD45+52(позитивными ) гематопоэтическими клетками.
Клетки высевались вчашки Петри и ко-культвировались 5 дней.Дифференцировку МСК в остеоциты оценивали по прокраске АлазаринаКрасного S и по кальцию, используя кит Stanbio Calcium (CPC)LiquiColour® Test Kit. Дифференцировку МСК в адипоциты оценивалипри помощи красителя на липидыOil Red Oв изопропаноле.Дифференцировку МСК в хондроциты оценивали по нормализованномуколичеству сульфатированных гликозаминогликанов (K-ASSAY®).Рис. 2.2.1. Контроль фенотипа эндотелиальных клеток.
Окраска клетокHUVECs на: (a) PECAM-1: (b) фактор Виллебранда.Метаболическую активность клетокоценивали методом AlamarBlue.Количество клеток оценивали по общему количеству ДНК в клеточнойпопуляции согласно методу PicoGreen.ЦитометрBD FACS Canto (Bioscience) использовался для анализамаркеров рецепторов МСК.
В качестве маркеров были выбраны CD90 (илиThy-1), CD73 (экто-5'-нуклеотидазы),53CD105 (эндоглин), CD19 (ко-рецептор, расположенный на поверхности B-лимфоцитов), CD34 (маркерранних этапах кроветворения) и CD45 (тирозиновая протеинфосфатаза Cрецепторного типа). Все антитела были прокрашеныфикоэритрином(PE). Данные анализировались при помощи программного обеспеченияFlowjo™. Все эксперименты на проточном цитофлуориметре повторялись3 раза.Исследование динамики прикрепления клетокВ экспериментах использовали следующие клеточные линии: L929, BHK–21,Vero и HEP-2.Количество прикрепленных клеток определяликак разность между начальным количеством клеток и количествомнеприкрепившихся клеток в суспензии через заданное время.Подсчетклеток осуществляли при помощи гемоцитометра.Распластывание клетокЭксперименты проводили на линии HeLa.
Клетки фиксировали вформальдегиде (3.7% в фосфатном буфере). После фиксации клеткиокрашивали 20 мин в 0.1% растворекристаллического фиолетового.Изображения получали при помощи микроскопа Zeiss Axioplan imagingmicroscope , снабженным камерой Zeiss AxioCam.Для прокраски актина использовалиродамин-фаллоидин. Послефиксации клеток (см. выше) клетки обрабатывали 0.5% раствора TritonX-100 в фосфатном буфере в течение 10 мин. После чего клеткипрокрашивалив растворе родамин-фаллоидина(MolecularProbes).Изображения получали при микроскопа Zeiss Axioplan imaging microscope.Определение ДНК в клеточной популяцииОбщее количество ДНК в популяции клеток оценивалось по методуPicoGreen (Invitrogen).
Метод основан на получении лизата клеток,выделении ДНК и связывании ДНК с интеркалируюшим красителем54(Blaheta et al., 1998). В большинстве экспериментов считалось, чтоколичество клеток в популяции пропорционально количеству общемуколичеству ДНК. Таким образом, можно судить о динамике клеточнойпопуляции.В экспериментах использовались прилагаемые в наборахДНК - красители, буферы и растворы со стандартами ДНК длякалибровки.Флуоресценцию измеряли на флуориметре Wallac VictorFluorescent Plate Reader.
Длина волны возбуждения – 480 нм, эмиссии –530 нм.Метаболическая активность клеток определялась методом alamarBlue(O'Brien et al., 2000; Hamid et al., 2004). Метод основан на измененияхоптических характеристик редокс-индикатора ресазурина, что в своюочередь, коррелирует сметаболической активностью клеток.Методможет быть реализован как во флуоресцентной моде, так и в режимепоглощения света. Эксперименты проводились согласно протоколамфирмы-поставщика (Biosource, CA, USA.).Сканирующая электронная микроскопияСЭМ применялась для анализа морфологии клеточных пластов.
Передфиксацией клетки промывалсь в буфере Хэнкса, фиксировались в 2 %растворе глютаральдегида. Далее образцы дегидрировали, проводя черезрастворы с возрастающей концентрацией этанола (50%, 60%, 80% и100%),послечегоклеткигексаметилдисилазане. Образцыинкубироваливысушивали,30впроводили напылениезолотом. Анализ проводили на микроскопе Hitachi S2600N.55минутАнализ экспрессии геновЭксперименты проводили на линии HeLa.
В работе использовали миничип Affymetrix Human Cancer G110 GeneChip c 2059 probe sets.изолировали при помощиChatsworth, СА).протоколамРНКRNeasy Mini Kit spin columns (Qiagen,Гибридизацию и окраску проводили согласнопроизоводителя(Affymetrix,HighWycombe,UK).Сканирование и анализ проводили при помощи программы AffymetrixMICROARRAY SUITE V. 4.0.Бесферментативное открепление клетокОткрепление клеток линии L929 получали при понижении температуры до5 0С путем замены среды культивирования на бессыворотчную среду.Регистрировалось время, в течение которого откреплялось 90 % клеток.Кинетику открепления клеток 3Т3 определяли прямым подсчетом клетокпри помощи гемацитометра. Наблюдали открепление отдельных клеток,клеточных агрегатов и клеточных пластов.После удаления средыкультивирования клетки дважды промывали раствором Хенкса при 37 °С.После промывания добавляли бессывороточную DMEM при температуре4-5 °С.
Далее культуру поддерживали при этой температуре. Каждые 10мин отбирали среду инкубирования с открепившимися клетками, добавляятакой же объем «холодной» бессывороточной DMEM.Цейтраферную съемку процесса открепления клеток 3Т3 осуществлялипри помощи микроскопа Olympus IX81-ZDC, оборудованным климаткамерой.Изображенияполучалиприпомощипрограммногообеспечения Andor IQ. Для съемки отбирались изолированные клетки,пары клеток и клеточные пласты.56Покрытиетермочувствительныхповерхностейфакторамиклеточной адгезииДля усиления адгезии клеток к субстратам мы использовали следующиефакторы: коллаген типа I, поли-L-лизин (ПЛЛ), ламинин и фибронектин.Коллаген типа I, выделенный из хвостов крыс, (3 мг/мл, растворен вуксусной кислоте) разбавляли до концентрации 200 мкг/мл в фосфатномбуфере.
150 мкл добавляли в лунку 24-ех луночной плашки. Покрытиевысушивали в ламинарном кабинете в течении ночи, поддерживаятемпературу 37 С. Перед экспериментомлунки промывали растворомХенкса с рН-индикатором до нейтрализации.100 мкл водного раствора поли-L-лизина (ПЛЛ) (20 мг/мл) наносили наповерхность лунки и высушивали в ламинарном кабинете в течении 3 ч.Мышиный ламинин-1 наносили на полимеры, добавляя в лунку 100мклфосфатного буфера(100 мкг/мл ).
Высушивание проводилианалогично высушиванию коллагена.Фибронектин наносили из раствора Хенкса, нанося 500 мкл растворав концентрации 16 мкг/мл. Через 2 ч раствор сливали. Поверхностьпромывали раствором Хенкса.Образцы анализировали при помощи АСМ и СЭМ.571.6 Методы исследования доставки лекарств из термочувствительныхполимеровДля исследования доставки лекарств в работе использовались сополимерына базеполи-(N-ИПААм-со-ААБФ).высушивания из раствора.Покрытия получали методомТолщина пленок составляла 5 мкм.Фотосшивку проводили согласно протоколу, приведенному в секции 1.2.Загрузка родамина В проводили из раствора абсолютного метанола.
Дляэтого 50 мкл родамина В растворенногов абсолютном метанолевконцентрации 0.4 mM наносили на покрытие и высушивали в течениеночи в диссикаторе. Далее пленки сушили в течение 4 ч в сушильномшкафу при 40 °С.Распределениеродаминавтермочувствительномпокрытииконтролировали при помощи конфокальной микроскопии. На рис. 1.3.1 (а)представлены микрофотографии оптических срезов покрытия.Нарис.1.3.1 (б) приведена оптическая реконструкция покрытия, полученнаяна основании совокупности оптических срезов.
Дистанция междусоседними срезами составляет 0.26 мкм.Можно заключить, чтораспределение родамина относительно равномерное и толщина покрытияблизка к 5 мкм.Для анализа кинетики выхода родамина Впроводили в специальной ячейкеэкспериментына базе 24-ех луночной плашки итермостола (IC22XT, Torry Pines Scientific) (Yang et al.,2013).При этом24 луночную плашку размещали на регулируемом термостоле (рис.1.3.2 ).Перемешивание водного раствора с родаминомосушествляли припомощи магнита с мешалкой. Общий объем раствора над полимернымпокрытием составлял 1 мл.58Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
