Диссертация (1097910), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Используя технику ДНК-чипов, были определены гены,экспрессия которых в клетках отлична(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)напо сравнениюНа основании экспериментальных данныхвсехспокрытиях поли-контролемможно(ПСКК).заключить, чтогидрофобные полимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) необеспечиваютустойчивый рост клеток, следовательно необходимомодифицировать поверхность таких термочувствительных покрытийфакторами адгезии, такими как коллаген типа I, ламинин I, фибронектини поли-L-лизин.Показано, что нанесение ФА значительно ускоряет рост клеток, но длякаждоготипаклетокитипаполимеранеобходимоподбиратьоптимальный ФА.Поскольку краевой угол дляпленок изполи-N-ИПААм,полученных методом центрифугирования, составляет приблизительно50град.,томожно предположить, что такое покрытие будетподдерживать рост клеток.
Действительно, покрытие толщиной 100 нм изполи-N-ИПААм, полученное методом центрифугирования, значительнолучше обеспечивает рост клеток, чем покрытия, полученные методомвысушивания из раствора.Рост клеток напокрытияхИПААм, полученных методом центрифугирования,из поли-N-не зависел оттолщины покрытия во всем диапазоне толщин (10нм-103 нм), чтосвидетельствует о том, что метод нанесения покрытия является ключевым18фактором при получении термочувствительных покрытий на основе полиСходный результат получен и для сополимеров на основеN-ИПААм.поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ).При этом изменение соотношениямономеров N-ИПААм и ЕПМ сополимера не влияло на скорость ростаклеток.
По-видимому, отсутствие концентрационной зависимости связанос тем, что краевые углы всех сополимеров на основе поли-(N-ИПААм-соЕПМ) находятся в диапазоне углов, характерных для адгезии клеток вкультуре (20-50 град.).Следующимклассомтермочувствительныхметодом центрифугирования,поли-(N-ИПААм-со-ААБФ)покрытий,полученныхбыли фотосшитые полимеры на основесотносительновысокимуровнемгидрофобности (краевой угол 80 град.).
Было показано, что клеточныйрост наблюдается лишь в случае сверхтонких пленок толщиной 13 нм.Увеличение толщины покрытия до 30 нм приводило к полномуингибированию клеточного роста.термочувствительныхТакое явлениеграфт-полимеровнаосновеизвестно дляполи-N-ИПААм(Akiyama et al, 2004; Fukumori et al, 2010). Авторы не приводят объясненияданного феномена, но связывают зависимость роста клеток от толщиныпокрытияразличной гидратируемостью ультратонких пленок, а такжеэффектом подлежащего субстрата.Открепление клеток от термочувствительногопокрытияпроисходит в результате набухания полимера. При этом в случаелинейных несшитых полимеров происходит растворение и выходполимера в водную фазу. Отрыв клетки от субстрата неизменносопровождается разрушением цитоскелета и осфериванием клетки.Сравнительный анализ открепления клеток от покрытий на основе поли(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) с толщиной 5 мкм продемострировал19зависимостьскоростиоткрепленияотгидрофобностисубстрата.Характерное время открепления клеток линии L929 составляло 0.5, 2.0, 30и 180 мин для полимеров с молярным отношением N-ИПААм и N-третБААм 100/0, 85/15, 65/35 и 50/50 соответственно.
Скорость откреплениязависела не только от гидрофобности субстрата, но и от метода полученияпокрытия. Дляпокрытий на основе поли-N-ИПААм,полученныхметодом центрифугирования, характерное время открепления клеток, какправило, составляло 10 мин. Как и в случае традиционной трипсинизацииклеток,скорость открепления в сильной степенизависелаоттипаклеточной культуры.При анализе процессов открепления клеток от термочувствительныхсубстратов целесообразно различать механизмы открепление единичныхклеток и клеточных пластов. Механизм открепления клеточных пластовсвязан с внутренними механическими напряжениями, которые приводят клокальному отделениюпласта клеток, после чего пласт волнообразнооткрепляется от подложки.Клетки в пластах фибробластовсохраняютмеханическую связность за счет элементов внеклеточного мактрикса, ноне за счет межклеточных контактов.
В случае эндотелиальных клетокклеточные контакты сохраняются и при откреплении клеточного пласта(Moran et al., 2007).Нами было исследовановлияние факторов адгезии наскоростьоткрепления клеток линии 3Т3. Скорость открепления клеток от наиболеегидрофильного сополимера поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) (85/15) независела от белка, которым модифицированы термочувствительныепокрытия.Для сополимеров (65/35) и (50/50) скорость открепленияклеток резко уменьшалась, при этом динамика открепления зависела оттипа ФА.20В отдельном параграфе рассматривается поведение МСК человекана термочувствительных покрытиях.В экспериментах по росту ибесферментному откреплению клеток нами было исследовано поведение12-ти типов первичных клеток и перевиваемых клеточных линий, ноанализ поведения стволовых клеток человека мы выделили в отдельныйпараграф, посколькуименно этот тип клетокявляется наиболееперспективным для использования в регенеративной медицине, тканевойинженерии и клеточной терапии.ДанныепоэкспрессиимаркеровдифференцировкиМСКсвидетельствуют, что фенотип МСК не меняется при пролонгированномкультивировании на термочувствительных материалах.впервыебылопоказано,чтопокрытия,Кроме того,полученныеметодомвысушивания, на основе поли-N-ИПААм могут успешно использоватьсядлякультивирования МСК, а также для полученияостеобластов,хондроцитов и адипоцитов.Глава 4 посвящена исследованию управляемой доставки лекарствиз термочувствительных покрытий.
Для того, чтобы покрытия моглииспользоваться для доставки лекарств, т.е. бытьрезервуаром длялекарства, пленки должны обладать достаточной емкостью (объемом).Характерная толщина пленок рассматриваемых в данной главе – 5 мкм.Отметим, что покрытия с толщиной порядка (1-100) мкмактивноиспользуются в медицинских изделиях для локальной доставки лекарств,например, в кардиоваскулярных стентах.Для анализа доставки лекарств из термочувствительных покрытийнами были предложены физическая и математическая модели процессовпереноса. В качестве модельного соединения мы выбрали красительродамин В (Mw= 451 D).В качестве полимера-носителя21поли-(N-ИПААм-со-ААБФ).
Покрытия толщиной 5 мкм формировали методомвысушивания из раствора.Метод получения полимерных сеток припомощи фотореакции описан в нашей работе (Yang et al., 2013).Для описания процессов доставки лекарств из термочувствительныхпокрытий нами была предложена математическая модель, котораяописываетдиффузиюлекарстваизпленокприизменяющихсятемпературных режимах.
Концентрация родамина B в пленке мала, чтодает возможность использовать приближение слабых растворов ивоспользоваться законом Фика и уравнениями диффузии для переносавещества.Экспериментальные данные по циклической элюции родамина В изтермочувствитедльных покрытий на основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ)соответствовали данным полученным на базе диффузионной модели .Традиционно в работах по доставке лекарств из полимеров с НКТРтемпературный контроль осуществлялся принудительным изменениемтемпературы водного окружения (применялись термостаты, проточныесистемы, термостолы и т.д.). В настоящее время не существует устройствпозволяющих локально понижать температуру собственнно полимерногоматериаласНКТРилиносителя,накоторомэтотполимериммобилизован.
Нами впервые было предложено использовать механизмлокального охлаждения, основанный на применении элемента Пельтье.Опытныйобразецводонепроницаемымбылсобраннаполимернымбазепокрытием.элементапокрытогоЦиклическийрежимдоставки лекарств удалось продемонстрировать на 3-х циклах изменениятока, подаваемого на элемент Пельтье.В заключении сформулированы основные результаты работы.22Публикации по теме диссертацииАвтором по теме диссертации опубликовано в рецензируемыхжурналах из списка ВАК и библиографических баз Scopus и Web ofScience 36 статей и одна глава в коллективной монографии.
Кроме того,автором опубликованы 3 статьи по материалам конференций и 11тезисов, индексируемых в библиографических базах Scopus и Web ofScience.Статьи в рецензируемых журналах1. Satyam A., Kumar R., Fan X., Gorelov A., Rochev Y., Joshi L., Selgas H.P., Lyden D., Thomas B., Rodriguez B., Raghunath M., Pandit A. andZeugolis D., Macromolecular crowding meets tissue engineering by selfassembly: A paradigm shift in regenerative medicine // Adv.Mater.- 2014, V.26(19),-P.3024-3034.2. Meere M.G., Tuoi Vo, Yang R., Aldabbagh F., Carroll W., Rochev Y., AThermally Activated Drug Delivery System Based on a ThermoresponsivePolymer and a Cooling Device: a Theoretical Assessment // J.
Thermal Sci.Eng.-2014,-V.6(2),-N 021012.3. Fan X., Nosov M., Carroll W., Gorelov A., Elvira C., Rochev Y.,Macrophages behaviour on different NIPAm based thermoresponsivesubstrates // J. Biomed. Mater. Res.(A)-2013,V.102(8), - P.2901-2910.4. Yang R., Gorelov A.V., Aldabbagh F., Carroll W.M., Rochev Y., Animplantable thermoresponsive drug delivery system based on Peltier device// Int. J.
Pharm.-2013, V.447(1-2), -P.109-114.235. Hopkins C., McHugh P.E., O'Dowd N.P., Rochev Y., McGarry J.P., Acombined computational and experimental methodology to determine theadhesion properties of stent polymer coatings // Computational Mater. Sci.2013,-V.80, P.104-112.6. Nash M.E., Fan X., Carroll W.M., Gorelov A.V., Barry F.P., Shaw G.,Rochev Y.A., Thermoresponsive Substrates used for the Expansion ofHuman Mesenchymal Stem Cells and the Preservation of Immunophenotype// Stem.Cell. Reviews and Reports.- 2013,- V.9 (2), -P.148-157.7. Nash M.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
