Диссертация (1097910), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Rochev Yu., Gorelov A., Golubeva T., Selezneva I., Gavrilyuk B., Celldetachment from thermoresponsive polymeric substrates as a function ofpolymer composition and crosslinking, Transactions - 7th WorldBiomaterials Congress, P. 313; Sydney; Australia; 2004; Code 64310.6. Satyam A., Kumar P.,Fan X., Rochev Y., Joshi L.,Peinado H.,Lyden D., Thomas B., Rodriguez B., Raghunath M., Pandit A., ZeugolisD., Modulation of the in vitro microenvironment to accelerateextracellular matrix deposition: macromolecular crowding meets tissueengineering by self-assembly,Journal ofTissueEngineering andRegenerative Medicine, Volume: 8 Pages: 124-124 Supplement: 1Special Issue: SI Meeting Abstract: OP155, JUN 2014.7.
Kumar P., Satyam A., Fan X., Rodriguez B., Rochev Y., RaghunathM., Pandit A., Zeugolis D., Development of extracellular matrix richhuman corneal stroma substitute, Journal of Tissue Engineering andRegenerative Medicine, Volume: 8Pages: 196-196Supplement: 1Special Issue: SI Meeting Abstract: OP287, JUN 2014.8. Satyam A., Kumar P., Fan X., Rodriguez B., Joshi L., Rochev Y.,Raghunath M., Pandit A., Zeugolis D., The in vitro micro-environmentinterface: macromolecular crowding meets cell-sheet tissue engineering,Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, V.
6, P. 201201, Supplement: 1 Special Issue: SI, SEP 2012.9. Gorelov A., Ryder A., Carroll W., Rochev Y., Thermoresponsivecopolymers for tissue engineering and drug delivery, 8th Annual Meetingof the Tissue Engineering Society International (TESI), 2005, TissueEngineering .- 2006,-V. 12 (4), P. 1078-1078 , Meeting Abstract: 274.10.Kavanagh C.A., Rochev Y., Gorelov A.V., et al., Surface expression ofICAM-1 on human endothelial cells grown on potential intra-vascular30stent coatings, 14th Annual Symposium of the London HypertensionSociety, British Journal of Clinical Pharmacology.-2003,- V. 56, 2,P.240-240.11.
Doorty KB, Golubeva TA, Gorelov AV, Rochev YA, Allen LT, DawsonKA, Gallagher WM, Keenan AK Investigation of co-polymer films asdrug delivery systems for prevention of vascular smooth muscle cellproliferation, Meeting of the British Pharmacological Society Location,British Journal of Pharmacology.- 2001,- V. 134,Supplement,P. 84.31Issue: ProceedingsГЛАВА 1Экспериментальные методы1.1. Термочувствительные полимерыВ работе использовались три группы полимеров с НКТР.4. Сополимеры N-изопропилакриламида(поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)),иаN-трет-бутилакриламидатакжесополимерыN-изопропилакриламида и акриламидобензофенона (поли-(N-ИПААмААБФ)) были синтезированы в группе А.В. Горелова в университетеДублина(School of Chemistry & Chemical Biology,UCD, Dublin,Ireland) и ИТЭБ РАН, Пущино.
Детали синтеза линейных сополимерови ковалентно сшитых полимеров представлены в наших работах(Gilchrest et al., 2004; Nash et al., 2012). Метод получения ковалентносшитыхгидрогелейнаосновеполи-(N-ИПААм-со-ААБФ),используемых для бесферментного снятия клеток приведен в работе(Nash et al, 2012). Формирование гидрогелей для доставки лекарствописано в работе (Yang et al.,2013).5. Поли-(N-изопропилакриламид) (поли-N-ИПААм) cо среднечисловоймолекулярной массой Mn в диапазоне 20-25КД согласно информацииот производителя (Sigma Aldrich).6. Сополимеры N-изопропилакриламида и этилпирролидон метакрилата((поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ)) синтезированы под руководствомDr.Carlos Elvira (Department of Applied Macromolecular Chemistry, Instituteof Polymer Science and Technology CSIC, Madrid, Spain).32Сополимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)Структура сополимера приведена на рис.1.1.1. Характеристики исинтез полимеров описаны в (Gilchrest et al., 2004).
Сополимеры получалиметодомрадикальнойполимеризации.Вкачествеинициатораиспользовался 2,2’-азо-бис-изобутиронитрил. В качестве растворителя –бензол. Для полимеризации через раствор мономеров и инициаторапропускали аргон. Реакция шла 24 ч при 60 0С. После окончания реакциисмесь преципитировали в н-гексане. Процедуру переосаждения повторялитрижды, растворяя смесь в ацетоне и вновь осаждая в н-гексане.Назаключительной стадии полимер досушивали при комнатной температурепри помощи вакуумной сушки.Рис.1.1.1. Химическая структура сополимера поли-(N-ИПААм-со-Nтрет-БААм).
Стрелка указывает на дополнительную метильную группув мономере N-трет-БААм по сравнению с мономером N-ИПААм.Сополимер поли-(N-ИПААм-со-ААБФ)Метод синтеза мономера ААБФ описан в работе (Nash et., al 2012).Структура сополимера приведена на рис. 1.1.2. Синтез сополимера поли(N-ИПААм-ААБФ) проводили аналогично синтезу поли-(N-ИПААм-со33N-трет-БААм)). Схема синтеза сополимера аналогична синтезу поли-(NИПААм-со-N-трет-БААм))приведенномувыше.Молярнаядолябензофенона в полимере с оставляла 1% и определялась методом ЯМР.Среднечисловаязначениемолекулярная масса Mn составляла 168, 000 г/моль,полидисперсностисоставляло8.84,согласноданнымколоночной гель -хроматографии.Рис.1.1.2.ААБФ).Химическая структура сополимера поли -(N-ИПААм-со-Сополимеры поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ)Подробное описание синтеза и характеристики сополимеровполи-(N-ИПААм-со-ЕПМ) приведены в (Nash et al., 2012).
Структура сополимераприведена на рис. 1.1.3. Сополимер был получен методом радикальнойсополимеризации в диметилфуране в бескислородной атмосфере азотапри 50°C в течение 24 ч. 2,2’-азо-бис-изобутиронитрил (1.5% моль) также34использовался как радикальный инициатор. После проведения реакцииполимер диализовали против воды и лиофилизовали. Молярные фракциимономеров определяли при помощи ЯМР спектроскопии. Колоночная гельхроматография применялась для определения молекулярных весов иполидисперсности. Характеристики полимеров приведены в Таб. 1.1. 1.CH3CH2CH2CHCmCnOCNHOOCH3C H CH3CH2CH2NOРис. 1.1.3.
Структура сополимеров поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ).Таблица 1.1.1. Характеристики сополимеров поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ).МолярноеотношениеN-ИПААм/ЕПМ100/090/1080/2070/3060/40Мw(104 Д)M w/Mn101213.516151.31.41.51.61.4351.2. Методы исследования термочувствительных полимеров врастворахДифференциальная сканирующая микрокалориметрияПоли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм). Эксперименты проводили надифференциальноммикрокалориметреадиабатическомДАСМ-4(НПОсканирующем”Биоприбор”).Скоростьсканирования - 5К/мин.
Избыточное давление 2 атм.сканирования - 1-50°С. Температура структурногоопределяласьДиапазонперехода Тнктрпо максимуму пика теплопоглощения. Изменениеэнтальпии (∆H), определяласьплощадью, ограниченной пикомтеплопоглощения и базовой линией. T1/2 – ширина пика на половинемаксимума теплопоглощения.Поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ).Экспериментывыполнялисьнамикрокалориметре VP-DSC (MicroCal, Northampton, MA). Концентрацияполимера в деионизованной воде составляла 1 %(10мг/мл). Передизмерением все образцы подвергали дегазации.
Скорость сканированиясоставляла 1.0 ºК /мин. Избыточное давление составляло 2 атм. Во всехэкспериментах не наблюдалась разница между данными первогоипоследующего сканирований.ТурбидиметрияСтруктурные переходы в водных растворах исследовали методомтурбидиметрии,сравниваяоптическоепропусканиеобразцаирастворителя, в данном случае, воды.
Измерение проводили на длиневолны λ=500 нм. Измерения проводилина спектрофотометрах,оснащенном термостатируемыми кюветами (“Hitachi U-3410”, Cary 100UV-Vis). Скорость нагрева/охлаждения исследуемых образцов составила360. 1 или0.2оС/мин. Температура агрегации (Тагр)полимеров былаопределена как точка перегиба кривой температура- светопоглощение,полученной при нагреве водных растворов полимеров.1.3. Методы получения термочувствительных покрытийВ экспериментах с культурами клеток, а также при определениифизико-химическихразличныехарактеристикподложки,напокрытий,которыенаносилибылииспользованытермочувствительныеполимеры.
Типы подложек, а также экспериментальные методы, вкоторых они использовались, приведены в таб.1.3.1.Получение покрытий методом центрифугированияНесмотря на то, что теория этого метода разработана не полностью, тем неменее, в рамках существующих упрощенных моделей удается определятьэмпирическиепараметрамисоотношениякакмеждуконцентрациятакимираствораэкспериментальнымиполимерас,вязкостьполимерного раствора µ, угловая скрость вращения ω, скорость испарениярастворителя, время центрифугирования τ и толщина покрытия h.
Это всвоюочередь,даетвозможностьполучатьпленкисзаданнымипараметрами, такими как толщина и шероховатость (Emslie et al., 1958;Bornside et al., 1993; Hall et al., 1998; Schubert and Dunkel, 2003) На рис.1.1.4 приведены зависимости толщины покрытия от скорости вращения иот концентрации полимера.37Рис.1.3.1. Зависимость толщины покрытий от скоростицентрифугирования и от концентрации раствора. Толщина покрытийопределялясь лазерной профилометрией.Полученные зависимости позволяютстроить соответствующиекалибровочные кривые, подбирать концентрацию раствора и параметрыцентрифугирования для получения покрытий заданной толщины.В работе использовалось устройстводля получения покрытийметодом центрифугирования: Laurell Technologies WS-400B-6NPP/LITEspin coater. Чашки Петри (d=35 мм) , диски Thermanox (d=25mm) (Nunc)икварцевыестеклаПрограммируемоеиспользовалисьустройстводлявкачествеподложки.центрифугированияпозволилозадавать режимы вращения субстрата.
На первом этапе на субстратнаносилось 150 мклполучали враствораполи-N-ИПААм. Раствор полимеровбезводном этаноле. Концентрация раствора полимераварьировала в диапазоне 1% - 20%. Продолжительность «медленного»вращения составляла 9 сек. Скорость вращения - 150 об/мин.
На втором,быстром, этапе скорость вращения могла варьировать от 300 до 8000об/мин. Продолжительность центрифугирования также могла варьировать,но в большинстве экспериментов составляла 30 сек. На первых этапах38формирования пленок качество покрытий контролировалось при помощифазово-контрастной микроскопии.Таб.1.3.1. Подложки для термочувствительных покрытий.СубстратыЭкспериментальные методыThermanox® *Культивирование клеток, АСМ для анализатолщиникраевыхшероховатости,углов,измерениефотоэлектроннаяспектроскопияКварцевое стеклоЛазерная абляция, АСМ для анализа толщинишероховатости,сканирующаяэлектронная микроскопия, профилометрия,определение характеристик фотореакции,наноиндентированиеЧашки Петри и Культивирование клеток, фотоэлектроннаямноголуночныеплашки для культур спектроскопияклетокНержавеющая сталь Инфракраснаяспектроскопияполногоотражения* Thermanox® - полиэтилентерефталат (ПЭТ), обработанныйплазмой.
Пластинки на основе Thermanox изначально разработаны дляработ с клеточными культурами.Дефектныепокрытиясхарактернымидляметодацентрифугирования макропаттернами рис.1.3.2 отбраковывались. На рис.391.3.3 указаны границы покрытой полимером зоны.
На заключительномэтапе покрытия высушивали в вакууме при 40 0С.Рис. 1.3.2. Характерные паттерны дефектов, возникающих при методецентрифугирования. а) Пузырьки воздуха; б) Высокая вязкость,наносимого раствора полимеров; в) Недостаточная продолжительностьвращения; г) Недостаточный объем наносимого полимера или слишкомвысокая скорость вращения; д) Наличие нерастворенного полимера; е)Неоптимальный вукуумный прижим субстрата.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
