Диссертация (1097910), страница 8
Текст из файла (страница 8)
1. 3.1 а) Серия оптических срезов, полученных при помощиконфокальной микроскопии. Родамин В (20 нмол/мг) распределен в пленкеиз поли-(N-ИПААм-ААБФ). Расстояние между соседними срезами 0.26мкм. б) Распределение родамина В в термочувствительном покрытии.3-ех мерная реконструкция на основании оптических срезов.59ВодаМагнитПористаямембранаПленка сродаминомНагревательМешалкаРис.1.3.2 Ячейка для исследования выхода родамина В изтермочувствительного покрытия.На первом этапе исследовался выход родамина из полимерных покрытийпри различных температурах.измерениесоответствовалоВ этих экспериментах одно временноеоднойлункеплашки.Всеизмеренияпроводили трижды.
Перед началом измерения поверхность промывалидистилированной водой(40 ◦C), удаляя неспецифическидваждысвязавшийся с поверхностью краситель. Далее в заданное время из общегообъема отбирали 1 мл для анализа на спектрофлюориметре. Такой жеобъем вновь добавляли в ячейку. Остаток красителя элюировали при 40°С и также оценивали на спектрофлюориметре. В случае циклическогоизменения температуры 1мл рвствора заменялся на 1 мл «свежего»раствора соответствующей температуры.60В экспериментах с элементом Пельтье использовался элемент покрытыйводонепроницаемым полимерным покрытием от Radionics ( Peltier device(20×20×3.8 mm3; ETC-031-14-11-E).Источник питания (EX752M,AIM&Thurlby Thandar Instruments) использовался в режиме постоянноготока.\61Глава 2Физико-химические характеристики термочувствительныхпокрытийВведениеВ настоящей работе мы определяем термочувствительные полимерыкак полимеры с нижней критической температурой растворения (НКТР).В водном растворе такие полимеры при повышении температуры вышекритической выпадают в осадок.
В гелях на основе полимеров с НКТРнаблюдается переход из набухшего состояния в коллапсированное.Основы теории перехода клубок-глобула в гомополимерах в растворебыли заложены в работах (Flory, 1953; Птицын и Эйзнер, 1965; Lifshitz etal., 1978). Коллапс полимерных сеток был предсказан в работе (Dusek andPatterson, 1968) и впервые охарактеризован в работе (Tanaka 1978).По-видимому, наиболее подходящим полимером для получениятермочувствительныхпокрытийявляетсяполи-N-ИПААм,НКТРкоторого близка к 32 °С, а переход характеризуется малой полушириной ивысокой кооперативностью.Важным свойством данного полимераявляется слабая зависимость температуры перехода от молекулярной весаполимера. N-ИПААм относительно легко сополимеризовать как с болеегидрофобными, так и с более гидрофильными мономерами, что позволяетварьировать НКТР в максимально широком диапазоне температур.Поли-N-ИПААм впервые был описан в следующих патентах: Sprechtet al., 1956a; Sprecht et al., 1956b.
Однако до работы (Heskins and Guillet,1968), в которой было показано наличие НКТР,62поли-N-ИПААм непривлекал к себе специального интереса. Фазовый переход в полимерныхсетках на основе поли-N-ИПААм впервые был изучен в работе Hirokava,and Tanaka, 1984.В нашей работе мы рассматриваем несколько сополимеров NИПААм, как для бесферментного снятия клеток, так и для доставкилекарств (рис.2.1).Рис.2.1 Структуры термочувствительных сополимеров.
А) Поли-(Nизопропилакриламид)(поли-N-ИПААм);Б)СополимерNизопропилакриламида и N-трет-бутилакриламида (поли-(N-ИПААм-со-Nтрет-БААм));В)СополимерN-изопропилакриламидаиакриламидобензофенона (поли-(N-ИПААм-со-ААБФ)); Г) Сополимер Nизопропилакриламида и этилпирролидон метакрилата (поли-(N-ИПААмсо-ЕПМ)).На рис.2.2 представлены структуры сополимеров, их НКТР, а такжеобласти их применения в настоящей работе.63Нами были исследованы сополимеры на основе N-ИПААм и Nтрет-БААм с молярным соотношением N-ИПААм и N-трет-БААм: 100/0,85/15, 65/35 и 50/50,а также сополимер N-ИПААма и ААБф (поли-(N-ИПААм-со-ААБФ)) с молярным соотношением 99/1. Кроме того, намивпервые были синтезированы сополимеры поли-(N-ИПААм- со-ЕПМ) смолярным отношением N-ИПААма и ЕПМ 90/10, 80/20, 70/30 и 60/40соответственно.Рис.2.2.
Структуры сополимеров на основе поли-N-ИПААм, НКТР иобласти применения.64На основании перечисленных термочувствительных полимеровбыло получено более 20-ти различных термочувствительных покрытий. Вработеиспользовались двацентрифугированияцентрифугированияиметодметода нанесениявысушиванияизпокрытий:растворов.методМетод(“spin coating” или “spin cast” в англоязычнойлитературе) - один из наиболее эффективных способов получениягомогенных и «гладких» полимерных покрытий с толщинами в диапазоне10 нм - 10 мкм на плоских подложках.
Метод высушивания из растворапозволяет получать покрытия как на плоских подложках, так и в чашкахПетри и многолуночных плашках для культивирования клеток. Толщинатаких покрытий составляла 1-10 мкм. В сводной таб. 2.1 представленыпокрытия,которые использовались для бесферментного снятия клеток.Для доставки лекарств нами были использованы покрытия из поли-(NИПААм-со-ААБФ), полученные методом высушивания из раствора.Толщина покрытий составляла 5 мкм.Внастоящеевремяопределеныосновныефизико-химическиехарактеристики поверхностей биоматериалов, определяющие поведениеin vitroклеток(Zeiger at al., 2013). Среди них, свободная энергияповерхности γ, топография поверхности , механические характеристикиповерхност - модуль Юнга (Е) и твердость (Н), а также химическаяструктураповерхности.Именноэтихарактеристикиявляютсяопределяющими при разработке материалов для культивирования клеток.Длятонких и ультратонких покрытий толщина (h) такжеможетсубстрата и клеточной адгезией было показано, что оптимальное значениекраевых углов смачивания θ должно находиться в диапазоне 20-65 град, асвободнаяэнергияповерхностидолжнабытьвыше 45Шероховатость (RMS) стандартных покрытий для культур клеток65мДж/м2.Таб.
2.1. Термочувствительные покрытия, используемые длябесферментного открепления клеток.ПолимерыМетод полученияТолщинаДополнительныехарактеристикиполи-NИПААмполи-(NИПААм-со-Nтрет-БААм)Центрифугирование 30-2000 нмВысушиваниераствораиз 1-10 мкмЦентрифугирование 100-1000 нмВысушиваниераствораиз 1-10 мкмПоли-(NИПААм-соААБФ)Центрифугирование 10-100 нмполи-(NИПААм-соEПM)ЦентрифугированиеМодификацияФА*Полимернаясетка (гель)100 нм*Факторы адгезии: коллаген I, ламинин I, фибронектин, поли-L-лизин.не превышает 30 нм.В случае термочувствительных покрытийдополнительно должны быть определены термодинамические параметрыперехода полимера из гидрофобного в гидрофильное состояние.
В таб.2.2приведены характеристики поверхностей, а также основные физическиеметоды, используемые в настоящей работе.66Таб. 2.2. Характеристики покрытий и основные методы физикохимических исследований, применяемых в настоящей работе.Характеристики покрытийТолщина (h)Шероховатость (RMS)Модуль Юнга (Е)Краевые углы натекания (θн)Анализ белковых структур наповерхности покрытийХимическая структура иэлементный составОбразование молекулярнойсеткиРаспределение родамина Вв полимерной пленкеОпределение концентрацииродамина ВЭнтальпия перехода ( Н),НКТР и полуширина перехода(Т1/2)Методы исследованияАтомно-силовая микроскопияАбляция поверхности и профилометрияСканирующая электронная микроскопияАтомно-силовая микроскопияНанотвердомерОптическое определение краевого угла,(метод лежащей капли)Атомно-силовая микроскопияСканирующая электронная микроскопияИнфракрасная Фурье-спектроскопияРентгеновская фотоэлектроннаяспектроскопияУФ спектроскопияКонфокальная микроскопияСпектрофлуориметрияДифференциальная микрокалориметрия,Турбидиметрия672.1 Исследование растворов термочувствительных полимеров2.1.1 Термочувствительные полимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-Nтрет-БААм)Нами былиисследованысополимеры с молярным соотношением N-ИПААм и N-трет-БААм: 100/0, 85/15, 65/35 и 50/50.
Термодинамическиехарактеристики сополимеров оценивали при помощи дифференциальнойсканирующей микрокалиметрии. Типичные термограммы растворовсополимеров приведены на рис. 2.1.1.1.10ПНИПАааПНИПА/НТБА 85/15ПНИПА/НТБА 65/35ПНИПА/НТБА 50/50Ср, кал/гК8642001020304050оТемпература, СРис.2.1.1.1. Зависимость избыточной теплоемкости растворовсополимеров поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) в воде.
Концентрациярастворов 0.1%. Скорость сканирования - 0.5 К/мин.68Значение энтальпии для фазового перехода поли-N-ИПААм (∆Н) в воде врасчете на моль мономеров N-ИПААм составляет 1.36 ккал/моль, чтосоответствует значению 1,5 ккал/моль, приведенному в работе Shild, 1990.Сводные данные по термодинамическим характеристикам переходовприведены в таб. 2.1.1.1. Зависимость НКТР от содержания N-трет-БААмприведена на рис. 2.1.1.2. Сходные данные для этого же классасополимеров приведены в работе Hoffman et al, 2000. Хотя зависимостьНКТР от температуры не является линейной, тем не менее, на практикеможно достаточно точно получать необходимую температуру переходапри соответствующих молярных соотношениях N-ИПААм и N-третБААм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
