Диссертация (1097910), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Этот метод ненашел широкого применения из-за высокой доли погибших клеток врезультатевоздействияальтернативойультразвука.применениюПотрипсинатермочувствительных материалов.110настоящему,сталосерьезнойиспользованиеТермочувствительные покрытия для бесферментного открепленияклетокПервые работы по использованию термочувствительных полимеров длябыли опубликованы в 1990г.бесферментного открепления клетокнезависимо двумя японскими группами (Takezawa et al., 1990; Yamada etal., 1990). Takezawaс соаторами использовали для роста дермальныхфибробластов конъюгат поли-N-ИПААм с коллагеном, объясняя выборматериала тем, чтоадгезию клеток.покрытие из поли-N-ИПААмВ статьене обеспечивалоне приводились физико-химическиехарактеристики покрытий и не исследовалась динамика роста клеток.Если работа Takezawa носила откровенно предварительный характер, торабота второй группы под руководством Okano заложила стандартыисследованиявобластибесферментногооткрепленияклеток.Вдальнейшем эта группа опубликовала десятки работ по изучениютермочувствительных полимерови именно в этой группе былиосуществлены первые пересадки пластов клеток человека, полученныхметодом бесферментного снятия.
Авторы предожили метод получениятермочувствительныхпокрытий,основанныйэлектронного луча для полимеризациинаиспользованииN-ИПААма на поверхностипластиковых чашек Петри, т.е. получения графт-полимеров. В работахоценивали краевые углы нового материала, адгезию клеток и динамикуклеточного открепления.В следующей работе (Rollason et al., 1993)использовались сополимеры поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) с НКТР8°С.
Использование покрытий сданной температурой переходаподдерживало гидрофобность покрытия при комнатной температуре ипозволяло проводить рутинные операциис культурами клеток (сменасреды культивирования, наблюдение под микроскопом и т.д.). Покрытияобладали слабойспособностью к адгезии клеток, но обеспечивали111бесферментное открепление.Для анализа поверхности авторыиспользовали метод рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии,позволяющий оценить элементный состав поверхности на глубине 10 нм.Этот метод в дальнейшем нашел широкое применение при анализетермочувствительных покрытий.Подавляющеебольшинстворабот,посвященныхпроблеметермочувствительных биоматериалов, проведено на поли-N-ИПААм,однако продолжается поиск и новых материалов для клеточных культур,способных реагировать на небольшие изменения температуры (Von Recumat al., 1998, a,b; McMahon at al., 2011; Hoo at al., 2013).Факторы адгезииСлабая адгезия клеток к субстратам-подложкам – одна из типичныхпроблем, возникающих при культивировании клеток млекопитающих.Одним из способов улучшения адгезии клеток является нанесениефакторов адгезии клеток на подложки.детальноисследованонемалоВ настоящее время известно ифакторов,необходимую клеточную адгезию.способныхобеспечиватьСреди них белки и гликопротеинывнеклеточного матрикса такие как коллаген (разных типов) (Kleinman etal., 1981), ламинин (Paulsson, 1992), фибронектин и витронектин (Ozturk,2005).
(Последние два фактора в растворимой форме обнаруживаются и вкрови). Кроме природных факторов адгезии применяют и синтетическиемакромолекулы, такие как, например, поли-L-лизин (Mazia et al., 1975).Механизмы действия факторов адгезии основываются на специфическомсвязыванииклеточныхрецепторов(обычноинтегринов)ссоответствующими участками связывания ФА.
В случае же поли-L-лизинамеханизмадгезиисвязансэлектростатическимвзаимодействиемположительного полимера и отрицательно заряженных клеток. На112сегодняшний день нет единого универсального фактора адгезии клеток,который бы гарантированно обеспечивал адгезию клеток к синтетическимсубстратам для культвирования клеток. Наиболее распространеннымфактором адгезии является фибронектин, рецепторами к которомуобладает подавляющее большинство клеток млекопитающих и человека.Основной тип рецепторов на фибронектин - α5β1, который встречается вомногих типах первичных клеток и клеточных линий (Hohenester, 2014).Коллаген также является широко распространенным фактором адгезии.Многие клетки обладают рецепторами на различные типы коллагена,наиболее распространенные среди них - интегрины α1β1 и α2β1.
Кроме того,фибронектин имея специализированный домен, может связываться сколлагеном (например, типа I). Таким образом, покрытие из коллагенаможет вызывать дополнительную адсорбцию фибронектина из сыворотки,содержащейся в среде культивирования. Еще одним распространеннымфактором адгезии является гликопротеин- ламинин, который представленв организме прежде всего в базальной мембране, рецептторы к ламининутакже присутствуют во многих типах клеток.Заметим, что как и уфибронектина, у ламинина также есть участок связывания с коллагеном.Примодификацииповерхностейфибронектиномиламинином,необходимо учитывать, что эти гликопротеины могут менять своюконформацию в зависимости от характеристик субстрата.
При этомменяется и их способность к взаимодействию с клетками в культуре(García et al.,1999).Заметим, что синтетические факторы адгезии наоснове полилизина (как L так и D формы) не обладают биологическойспецифичностью и не располагают специальными сайтами связывания.В нашей работе мы исследовали в качестве потенциальных факторовадгезии коллаген типа I, ламинин типа I, фибронектин и поли-L-лизин,т.е.
все наиболее распространенные факторы клеточного прикрепления(Пискарёва и др.1999; Moran et al., 2006; Moran et al, 2007).1133.1 Адгезия и пролиферация клеток на термочувствительныхпокрытиях.Рост клеток на покрытиях микронной толщиныПроцесс адгезии клеток включает в себя несколько стадий, таких какначальный контакт, прикрепление, распластывание и т.д. Каждый из этихпроцессов имеет свое характерное время. В нашей работе мы оценивалиобщее количество прикрепившихся клеток к термочувствительнымполимерам через 1- 3 часа.
При этом клетки, будучи прикрепленными ксубстрату, могут быть не полностью распластаны. В данной части работыбыли исследованы покрытия, полученные методом высушивания израствора.составлялаТолщина покрытий из (поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм))4-5 мкм. Исследования были проведены на двух линияхфибробластов L929 и BHK-23 и двух линиях эпителиальных клеток Vero иНЕр-2. Для линий фибробластов количество прикрепившихся клетокоценивали через 1 ч, а для линий эпителиальных клеток(рис.3.1.1).через 3 чХотя зависимость скорости прикрепления клеток откомпозиции сополимера различнадля всех четырех клеточных линий,общей характеристикой является относительно низкий уровень адгезииклеток на покрытиях из поли-N-ИПААм.114Рис.
3.1.1. Прикрепление клеток к субстрату на основе сополимеровполи-(N-ИПААм-N-трет-БААм). По оси абсцисс – мольное содержание NИПААм. Для линий фибробластов L929 и BHK-23 прикрепление оцениваличерез 1ч; для эпителиальных клеток Vero и НЕр-2 – через 3ч. Толщинапокрытий 4-5 мкм. (Пределы погрешностей соответствуютстандартному отклонению, n=3.)Аналогичные данные были получены для клеток в культуре через 48 ч.Результаты для четырех линий приведены на рис.3.1.2Во всех случаяхрост клеток на гомополимере поли-N-ИПААм был достоверно медленнее,чем на подложках из сополимеров. Этот результат соответствуетэкспериментальным даннымвыполненным на покрытиях, полученныхвысушиванием из растворов (Takezawa at al., 1990; Rollason et al., 1993).Слабая цитосовметимость покрытий из поли-N-ИПААм связана преждевсегос сорбцией воды верхними слоями покрытия, что приводит кнабуханию поверхности, о чем свидетельствует сильный эффект «stick and115slip” для микронных покрытий на основе поли-N-ИПААм (см.
рис. 2.2.3.7,а также Gilcreest et al., 2004).Рост клеток линии HЕp-2зависел от композиции сополимера иувеличивался с ростом содержания более гидрофобного мономера N-третБААм. Рост клеточных линий L929, BHK-21 иVero практически независел от композиции сополимеров.Рис. 3.1.2. Рост клеточных линий на сополимерах поли-(N-ИПААм-со-Nтрет-БААм) с молярным соотношением мономеров N-ИПААм и N-третБААм 100/0, 85/15, 65/35 и 50/50.
Начальное количество клеток принятоза 100% независимо для каждой клеточной линии. 48 часовкультивирования. Толщина покрытия – 4мкм. (Пределы погрешностейсоответствуют стандартному отклонению, n=3.)116Закономерности ростанаиболееподробноклетокбылиэпителиальных клеток HeLa.натермочувствительныхисследованынамиНа рис.
3.1.3насубстратахпримерелинииприведена численностьклеточной популяции на 1-й (N1) и 3-й (N3) день культивирования насополимерах поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) и в контроле на ПСКК.Число клеток в контроле значительно превышает количество клеток налюбом из сополимеров. Вместе с тем, относительный прирост клеток ви на сополимерах приблизительно совпадает (N3/N1).контролеИнтерпретируя эти данные в рамках логистической модели ростаклеточной популяции, можно заключить, что в случае полимерныхпокрытийнаблюдаетсязадержкаадгезииклеток,ноужеприкрепившиеся клетки входят в клеточный цикл, продолжительностькоторого, по-видимому, остается неизменной.Клеток/лунку300,00024ч72ч200,000100,000012345Рис.3.1.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
