Диссертация (1091824), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Пробу охладить до комнатной температуры и добавить5 мл смеси гексан:этилацетат в соотношении 5:13. Перемешать на орбитальном шейкере в течение15 мин и центрифугировать при 10000 об/мин 3 мин6. К оставшемусягидролизату добавить400 мкл НСlконц додостижения рН = 2-34. Отобрать органическийслой и упарить при 40ºС втоке азота5. Перерастворить в100 мкл метанола ианализировать методомВЭЖХ-МС/МС на ТГК7.
Повторить пп. 2-48. Перерастворить в100 мкл метанола ианализировать методомВЭЖХ-МС/МС на ТГККРисунок 4.8.3. Блок-схема проведения пробоподготовки волос канализу на ТГК и ТГКК методом ВЭЖХ-МС/МС.Процедура валидации раработанной методики с использованиеммодельных образцов волос с добавлением к ним аналитического стандартаТГКК была проведена в четыре этапа:4. Определение предела детектирования (ПД) и пределаколичественной оценки (ПКО).5. Определение линейного участка калибровочной кривой.6.
Определение повторяемости времени удерживания ТГКК.7. Определение повторяемости количественного определения ТГККс учетом погрешности прибора и пробоподготовки.В результате установлено: ПД = 50 пк/мг, ПКО = 500 пг/мг, линейныйучасток калибровочной кривой составляет 0,05-5 нг/мг (см. рис. 4.8.4),погрешность времени удерживания ТГКК не превысила 0,3 %, аповторяемость составила 18,5 %. Полученный уровень ПД удовлетворяеттребованиям Всемирного общества анализа волос (SOHT) к пределамобнаружения каннабиноидов в волосах [23].105Рисунок 4.8.4. Калибровочная кривая определения ТГКК в волосах.Разработанная методика удовлетворяет требованиям ГОСТ Р 8.5632009, предъявляемым к методикам измерения в Российской Федерации, истала применяться в экспертной практике Института криминалистики Центраспециальной техники ФСБ России.
Успешно проведена апробацияразработанной методики с использованием волос человека, эпизодическиупотреблявшего марихуану. Хроматограмма пробы представлена рис. 4.8.5а.Общее время, которое требуется на анализ одной пробы волос по даннойметодике, составляет не более 3х часов.106АБВРисунок 4.8.5. Хроматограмма пробы волос человека, употреблявшего марихуану (а), бланковой пробы волос (б) и массспектр ТГКК в положительной пробе волос (в).1074.9 Анализ внешней поверхности волос на наличие синтетическихканнабиноидов классов 3-нафтоилиндолы, индол-3-карбоксилаты ииндазол-3-карбоксамиды методов ГХ-МС/МСОдной из важных проблем в области химико-токсикологическихисследований на сегодняшний день являются так называемые«синтетическиеканнабиноиды»или«каннабимиметики».Данныесоединения являются веществами синтетического происхождения иполучили такое название за их способность связываться с СВ1 и СВ2(каннабиноидными) рецепторами ЦНС.
Таким образом, каннабимиметикидолжны обладать схожими токсикологическими свойствами с природнымиканнабиноидами (∆9-тетрагидроканнабинол, каннабинол и каннабидиол –компоненты конопли). В мире уже синтезировано большое количество такихвеществ и их химические структуры весьма разнообразны.Основная сложность химико-токсикологических исследованийвышеуказанных веществ заключается в том, что их токсическое действие иметаболизм до конца не изучены, а разовые дозы очень малы по сравнению сих природными аналогами. Так как экзогенные вещества поступают в волосыпреимущественно в нативном виде, это делает данный вид биообъектанаиболее перспективным для проведение химико-токсикологическогоанализа на наличие синтетических каннабиноидов.В литературе [104, 118, 120] описаны исследования тольковнутренней области волос.
В качестве инструментальных методовприменяются методы ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС. Используемый в работе [120]ГХ-МС – наиболее распространенный метод анализа волос, но менеечувствительный и селективный, чем ВЭЖХ-МС/МС. В то же времяпоследний – весьма дорогостоящий. Альтернативным ВЭЖХ-МС/МСметодом может служить газовая хроматография с тандемным массспектрометрическим детектированием (ГХ-МС/МС). В работах [110, 127]представлено успешное применение данного метода для анализа целевыхсоединений в моче, поэтому представлялось интересным исследоватьвозможности его использования для анализа волос.В ходе исследований в качестве аналитов были использованыпредставители наиболее широко распространенных классов синтетическихканнабиноидов: 3-нафтоилиндолов, индол-3-карбоксилатов и индазол-3карбоксамидов.Инструментальный анализ проводили на оборудовании компании―Agilent Technologies‖, состоящем из газового хроматографа модели 7890 итрехквадрупольногомасс-селективногодетекторамодели7000А.108Хроматограф был оснащен хроматографической колонкой HP-5MS длиной30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.Выбор хроматографической колонки осуществлялся на изучениихарактеристик существующих коммерческих образцов, областей ихприменения и сравнения с существующими аналогами, а также на изученныхлитературных данных [118, 120].
Объем вводимой пробы составлял 1 мкл ипроводился с помощью автосамплера в режиме деления потока всоотношении 10 : 1. Температура инжектора и интерфейса составляла 280 °С.Скорость потока газа-носителя (гелий) – 1,0 мл/мин. Температурный режимработы термостата хроматографа был подобран на модельной смесирастворов сравнения имеющихся соединений и представлен в табл. 4.9.1.Таблица 4.9.1. Условия работы хроматографаСкорость нагрева,КонечнаяВремяºС/минтемпература, ºСвыдержки, минНачальный–10021-й20280122-й353205ЭтапыДетектирование проводили в режиме мониторинга множественныхреакций (далее – MRM), которые также были подобраны с использованиемрастворов сравнения анализируемых соединений.
Время сканирования былоразбито на сегменты, в каждом из которых регистрировали не более 3хсоединений (см. табл. 4.9.2). Температура источника составляла 230ºС,задержка сканирования на растворитель – 5 минут.Таблица 4.9.2. Условия детектирования целевых аналитов№сегмента12Начальноевремясканирования, мин12.00Времяудерживаниевещества,минНазваниевеществаUR-144F12.91AB-PINACA-F13.32AB-PINACA14.1813.00109MRMпереходыЭнергиясоударения,эВ304→233304→213304→145304→233304→213304→145330→215330→1452020302020302030316.00AB-CHMINACA17.72418.05AB-FUBINACA18.13THJ-220118.70AM-220118.83AM-223323.98JWH-21024.0656718.6023.00PB-2224.22NM-220124.7324.60825.00PB-22F25.10925.90AM-122026.061026.50QCBL-BZ-F27.52312→241312→145312→117324→253324→145324→109360→285360→271360→215360→284360→270360→342458→400458→260369→341369→312369→270369→195358→214358→144358→116375→232375→144375→116376→232376→144376→116382→324382→184382→227396→252396→109203040203030202040202020204040204040204040202030В результате проведенного экспериментального анализа условийдетектирования каннабимиметиков были не только выбраны наиболеехарактеристические MRM переходы для каждого соединения, но и сделанопредположение о природе их дочерних ионов (см.
рис. 4.9.1).110111m/z = 369m/z = 312m/z = 195m/z = 340m/z = 270Рисунок 4.9.1. Предложенные пути фрагментации каннабимиметиков вячейке столкновений и их масс-спектрыНа основании сравнения масс-спектров и предложенных ионныхреакций (рис. 4.9.1) можно сделать вывод, что для каждой группысинтетических каннабиноидов существует один общий фрагментарный ион.Для 3-нафтоилиндолов таким ионом является с m/z = 270, который можноотнести к (1H-индол-3-ил)(нафталин-1-ил)-метаноновый радикалу.
Следуетотметить, что 1H-индол-3-ил)(нафталин-1-ил)-метанон − основополагающеесоединение данной группы. Для каннабиноидов группы индазол-3карбоксамидов общий фрагментарный ион с m/z = 145 можно отнести к1Н-индазол-3-карбальдегидный радикалу, который также входит в структурувсех соединений данной группы. Все характеристические ионы наблюдалисьпри энергии фрагментации 30 eV. Таким образом, для каждой группы112синтетических каннабиноидов можно выделить характеристическийдиагностический ион и с помощью режима «Product ion scan» проводитьскрининговый поиск данных фрагментов на хроматограммах пробпредположительно содержащих неизвестные аналоги каннабимиметиков.С помощью предложенной схемы скринингового анализа дляканнабимиметиков класса индол-3-карбоксилаты – NM-2201, PB-22 и PB-22Fбыли выделены общие фрагменты: индол и 1Н-индол-3-карбальдегид ихинолин-8-илоксиданил, которые характеризуются ионами m/z = 116 и 144соответственно.
Далее проведен анализ проб, содержащих данные соединения,в режиме «Product ion», установлены времена их удерживания и исходные(родительские) ионы. В результате были получены MRM переходы, которыедалее использовали для исследования внешней поверхности и внутреннейобласти волос.Для проведения исследований нами были выбраны такие основныепредставители классов каннабимиметиков, как JWH-210 и AM-2201(3-нафтоилиндолы), РВ-22, РВ-22F и NM-2201 (индол-3-карбоксилаты) иAB-PINACA, AB-FUBINACA и АВ-CHMINACA (индазол-3-карбоксамиды).Определение условий внешнего смыва проводили с помощьюмодельных образцов волос с заранее нанесенными на них целевымивеществами (AB-FUBINACA, JWH-210 и AM-2201) в количестве 1 мг.
Навескимодельных образцов волос составляли 100±5 мг.Проведено экспериментальное сравнение эффективности четырехосновных схем внешнего смыва, в которых были использованы метанол,ацетонитрил и смесь гексан:этилацетат в объемном соотношении 5:1.Поэтапное описание схем представлено в таблице 4.9.2. Для исследованиякаждой схемы использовали по три образца волос и вычисляли степениизвлечения целевых аналитов (α) по формуле, приведенной в п.
4.7.Таблица 4.9.3. Схемы проведения внешнего смываНомерэтапа11 схемаВыдерживание в5 мл метанола вультразвуковойбане прикомнатнойтемпературе втечение 30 мин2 схемаВыдерживание в5 мл ацетонитрилав ультразвуковойбане прикомнатнойтемпературе втечение 30 мин1133 схема4 схемаВыдерживание в5 мл метанола вультразвуковойбане прикомнатнойтемпературе втечение 30 минВыдерживание в5 мл смесигексан:этилацетат(5:1) вультразвуковойбане прикомнатнойтемпературе втечение 30 мин23Отбор органического слоя в чистые пробирки и упаривание в токе азота притемпературе 50ºСПерерастворениеПерерастворениеПерерастворениеПерерастворениесухого остатка всухого остатка всухого остатка всухого остатка в100 мкл100 мкл100 мкл100 мкл метанолаацетонитрилаацетонитрилаацетонитрилаРезультаты исследования четырех предложенных схем смыва свнешней поверхности волос представлены в таблице 4.9.4.Таблица 4.9.4. Степени извлечения целевых аналитовСхема№1234Степень извлечения, %AB-FUBINACAAM-2201JWH-21079.0%94.6%65.0%72.0%82.6%53.8%44.2%54.0%36.9%21.1%24.1%16.0%Самые низкие степени извлечения целевых аналитов наблюдались длясхемы 4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
