Диссертация (1091824), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Также для каждогоперехода экспериментально подбирали энергию соударения, при которойинтенсивность характеристического иона была максимальной. Полученныеэкспериментальные данные для детектирования морфина и кодеинапредставлены в таблице 5.2.2.123Таблица 5.2.2. Условия детектирования морфина, кодеина и норкодеина дляметода ВЭЖХ-МС/МС.ИсследуемоевеществоМол.масса,а.е.м.Родительскийион, m/zМорфин285,1286,1 [M+H]+Кодеин299,2300,1 [M+H]+Норкодеин285,1285,82 [M-H]+157,7181,7201,7211,7165,2183,7225,7243,7Энергиясоударения дляданного иона,эВ3935252425282422225,09243,10268,13303535Дочерниеионы, m/zВвиду отсутствия аналитического стандарта норкодеина SRM переходыдля его детектирования подбирали с использованием программногообеспечения «High Chem Mass Frontier 6.0» компании Microsoft Corporation(США), разработанного для прогнозирования вероятных реакцийпревращения исходных молекул в дочерние ионы, исходя из их структурнойформулы и типа ионизации (см.
таб. 5.2.2).Норкодеин и морфин по своему строению отличаются толькоположением метильной группы (см. рис. 5.2.1) и молекулярные массы у ниходинаковы. Это затрудняет их совместное детектирование. В связи с этим,для них выбраны такие SRM переходы, которые присуще только этимвеществам и не пересекаются между собой. На рисунке 5.2.3 представленысхемы SRM переходов для норкодеина, полученные путем прогнозирования.Данные переходы не характерны для морфина.124Рисунок 5.2.3. Прогнозированные схемы SRM переходов норкодеина дляисточника типа ESI при положительной ионизации.Полученные SRM переходы для норкодеина хорошо коррелируют слитературными данными [6]. На рисунке 5.2.4 представлены полученныеэкспериментальным путем хроматограмма и масс-спектр норкодеина в пробемочи человека, употреблявшего кодеинсодержащий препарат.Рисунок 5.2.4.
Хроматограмма и масс-спектр норкодеина в моче человека,принимавшего кодеинсодержащий препарат.В ходе исследований были проанализированы пробы мочи пятерыхдобровольцев, принимавших кодеинсодержащие лекарственные препаратыи 4 пробы трупной мочи. Содержание кодеина в лекарственных препаратахсоставляло 8 мг на таблетку. Мочу добровольцев отбирали через каждые2 часа в течение суток после приема.Количественную оценку содержания морфина и кодеина методомВЭЖХ-МС/МС проводили с помощью калибровочных образцов мочи сразличной концентрацией аналитов (см. рис.
5.2.5). Коэффициенты125корреляции калибровочных кривых по морфину и кодеину составили 0.9939и 0.9946 соответственно. Оценку содержания норкодеина в моче проводилиметодом внутреннего стандарта с пересчетом на содержания морфина впробе.Рисунок 5.2.5. Калибровочные кривые содержания морфина и кодеина вмоче, полученные методом ВЭЖХ-МС/МС.Результаты количественной оценки содержания целевых аналитов впробах представлены в таблице 5.2.3.Таблица 5.2.3. Результаты количественной оценки содержания морфина,кодеина и норкодеина в объектах исследования.12468121424246814Содержаниеморфина, нг/млСодержаниекодеина, нг/млСодержаниеноркодеина,нг/мл234Первый доброволец, «Коделак», 1 таблетка2385624209052523581291641651911397415338Второй доброволец, «Коделак», 1 таблетка453618168494712684230474193176140195604056Не детектировалиВремя отбора,ч.126Отношениеконцентрацийморфин/кодеин, ед.50,40,50,70,80,91,94,00,70,70,51,31,524246812142424681215242461024Труп 1Труп 2Труп 3Труп 4556Третий доброволец, «Пенталгин Н», 1 таблетка8151152252150198180187152211042237577635244Четвертый доброволец, «Пенталгин Н», 1 таблетка2422631567562045955411694586317661102219015731Пятый доброволец, «Пенталгин Н», 2 таблетки50237613745021017715474225953113453Другие объекты исследования3332926862584765335857157610202697-0,21,71,00,20,60,93,73,23,70,020,0212,439,622,814,6Из таблицы 5.2.3 следует, что содержание морфина в моче добровольцев,принимавших кодеинсодержащие лекарственные препараты, не превысило756 нг/мл за весь временной интервал.
Количество морфина в трупной мочепревысило 10 мкг/мл. Это на порядок выше его концентрации в моче послеприема кодеинсодержащих лекарственных препаратов. Содержание кодеинав образцах трупной мочи было соизмеримо с его концентрацией в пробемочи добровольца, принявшего 2 таблетки кодеинсодержащеголекарственного препарата. Отношение концентраций морфин/кодеин в мочедобровольцев составило 0,02-4,0, в трупной моче – 12,4-39,6. Во всех пробахдобровольцев в отличие от проб трупной мочи присутствовал норкодеин,причем динамика изменения его содержания по времени совпадала сколичественным изменением кодеина в моче, что является показателемупотребления кодеина.Дополнительно исследована возможность процесса перехода кодеина вморфин и обратно в биологической матрице мочи с различным значением рН127при хранении образца в холодильнике, нами был проведен следующийэксперимент.
У четырех добровольцев, не принимавших наркотическиесредства, психотропные вещества и кодеинсодержащие лекарственныепрепараты, были отобраны пробы мочи. На исследование отбирали 6 проб по5 мл от каждого образца мочи добровольцев. К трем из которых добавлялипо 2,5 мкг морфина, к остальным – 2,5 мкг кодеина. Далее для каждого изобразцов с морфином и кодеином доводили рН с использованием 1,0 Nводного раствора KOH и ледяной уксусной кислоты. Схема приготовленияобразцов из 1 пробы мочи добровольца представлена на рисунке 5.2.6.5 мл мочи + 2,5 мкгморфина рН 4,05 мл мочи + 2,5 мкгморфина рН 7,05 мл мочи + 2,5 мкгморфина рН 9,0Образец мочи одного добровольца5 мл мочи + 2,5 мкгкодеина рН 4,05 мл мочи + 2,5 мкгкодеина рН 9,05 мл мочи + 2,5 мкгкодеина рН 7,0Рисунок 5.2.6.
Схема приготовления проб для эксперимента по изучениювозможности взаимопревращения кодеина и морфина в моче при различномзначении рН в процессе хранения в холодильнике.Образцы помещали в холодильник с температурой плюс 4˚С на троесуток, затем анализировали согласно разработанной методике.В результате проведенных исследований на хроматограммах проб сморфином для всех значений рН пиков кодеина обнаружено не было.Аналогичная ситуация наблюдалась и для проб с кодеином. Следовательно,при хранении проб мочи в холодильнике взаимопревращения морфина икодеина не происходит ни при каких значениях рН.На основании проведенных исследований были определены следующиепоказатели употребления кодеинсодержащих препаратов:1.
Отношение концентраций общего морфина и общего кодеина в моченаходится в диапазоне 0,02-4,0.2. Концентрация морфина в моче не превышает 800 нг/мл.3. В пробе детектируется норкодеин, причем его содержание сравнимо сконцентрацией кодеина.1285.3 Определение ТГК-кислоты в моче с использованием методаВЭЖХ-МС/МС.Пробоподготовка образцов мочи для определения ТГК-кислоты включаетследующие стадии: гидролиз (щелочной) и экстракцию (жидкостьжидкостную или твердофазную).
Необходимо отметить, что при повышениитемпературы, под действием света и кислорода воздуха ТГК-кислотаразлагается, поэтому необходимо исключить использование высокихтемператур, а упаривание экстрактов лучше проводить в токе инертного газа.В различных литературных источниках [136-140] условия гидролиза,применяемого для разрушения глюкуронидов ТГК-кислоты значительноотличаются, поэтому на данном этапе было важно выбрать наиболееоптимальную температуру гидролиза и концентрацию щелочи. Диапазонтемператур гидролиза варьируется от комнатной температуры (20-25°С) до60°С, а концентрация щелочи (KOH или NaOH) от 1N до 10N.Для выбора условий гидролиза к 3 мл образца мочи, содержащегозаведомо известного количество ТГК-кислоты, добавляли по 200 мкл 1N, 5Nили 10N раствора KOH и выдерживали в течение 20 минут при различнойтемпературе (комнатная температура, 40 или 60°С).В результате проведенного исследования оказалось, что наибольшаяплощадь пика ТГК-кислоты получается при выдерживании пробы в течение20 минут при температуре 60˚С с добавление 5N KOH.Для выделения ТГК-кислоты из пробы мочи после гидролиза используютжидкость-жидкостную или твердофазную экстракцию при значениях рНсреды от 2 до 5.
Наиболее распространенным экстрагентом для ЖЖЭданного вещества является смесь гексана с этилацетатом в различныхсоотношениях. Для ТФЭ используются картриджи С18 Ser-Pac или иханалоги. Отметим, что метод жидкость-жидкостной экстракции являетсяболее дешевым и простым в исполнении. Поэтому проведен эксперимент поопределению наиболее эффективного соотношения гексан:этилацетата. Дляэтого к оставшемуся после очистки водному слою добавляли 3 мл смесирастворителей гексан:этилацетат в соотношениях: 3:1, 5:1, 7:1, 9:1 иперемешивали в течение 20 минут. Затем центрифугировали, отбираливерхний органический слой и упаривали его в токе азота при температуре неболее 40°С.
Реконструировали сухой остаток в смеси гексан:изопропанол всоотношении 1:1, так как авторы [136] показали, что в данном растворителеТГК-кислота наиболее стабильна.Анализ хроматограмм показал, что наиболее оптимальным являетсясоотношение растворителей 5:1, т.к. с увеличением количества этилацетата в129смеси увеличивается количество мешающих компонентов матрицы, а с егопонижением уменьшается количество выделяемой ТГК-кислоты.Инструментальный анализ проводили методом ВЭЖХ-МС/МС согласноусловиям, представленным в п.
4.8 данной работы.В результате серии проведенных экспериментов разработана методикаанализа ТГКК в моче методом ВЭЖХ-МС/МС (см. Приложение). Пределобнаружения данной методики составил 1 нг/мл. На рисунке 5.3.2представлена калибровочная зависимость содержания ТГКК в моче.Рисунок 5.3.2. Калибровочная зависимость содержания ТГК-кислоты вмоче.В результате апробации данной методики было проанализировано юолее100 образцов мочи добровольцев. На рисунке 5.3.3 представленахроматограмма положительного образца мочи, полученного в процессеапробации.Рисунок 5.3.3.
Хроматограмма и масс-спектр ТГКК в моче1306. ВЫВОДЫ1. Изучена адсорбция (1-пентил-1Н-индол-3-ил)(4-этилнафталин-1ил)метанона на измельченных темных и светлых волосах иустановлены ее закономерности: наиболее точно она описываетсямоделью Фрейндлиха, которая характеризует гетерогенностьповерхности волос.2. Определено, что адсорбция JWH-210 на темных волосах выше, чемна светлых и обнаружено наличие как минимум трех центровадсорбции.
Предположено, что на первых центрах адсорбция можетбыть связана с пористостью адсорбента. Адсорбция на центрахвторого типа характеризуются дисперсионным и ориентационнымвзаимодействиями между СО-группами кератина и индольнойгруппой адсорбата. На третьих – образованием водородных связеймежду атомом кислорода в молекуле JWH-210 и карбоксильнымиили NH-группами меланина.3. Экспериментально определены условия щелочной деструкции(выдержка в 1,5 N водном растворе KOH при 60°С в течение часа)и жидкость-жидкостной экстракции (гексан : этилацетат (2:1, v:v)для извлечения стимуляторов, анальгетиков, галлюциногенов иантидепрессантов из матрицы волос с максимальными степенямиизвлечения (20%≤α ≥90%).4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
