Диссертация (1091824), страница 16
Текст из файла (страница 16)
оставшихся на поверхности наркотических средств и психотропныхвеществ) и потожировых загрязнений. В предыдущем эксперименте былаэкспериментально подобрана наиболее оптимальная схема отмывки волос отстимуляторов и наркотических анальгетиков. Однако в случае каннабиноидов97ввиду их высокой липофильности требуется дополнительная стадия отмывкисмесью гексан:этилацетат в соотношении 5:1[141] . Необходимость даннойстадии была установлена экспериментально в ходе проведения контроляотмывки «модельных» волос. Таким образом, схема проведения отмывки волосот природных каннабиноидов выглядит следующим образом (см. рис.
4.7.1).Выдержка волос в4 мл Н2О сдобавлением 5 мгдодецилсульфатанатрия в ультразвукев течение 30 минВыдержка в4 млхлороформа вультразвуке втечение30 минВыдержка в4 мл метанолав ультразвукев течение30 минВыдержка в4 мл смесигексан:этилацетат (5:1) вультразвуке втечение 30 минРисунок 4.7.1. Схема проведения отмывки внешней поверхности волосот природных каннабиноидов и потожировых загрязнений.Предложенный метод анализа внешней поверхности волос наканнабиноиды (ТГК, КНБ и КНД) был апробирован на пробах реальныхобразцах волос людей, употреблявших данные вещества.
На внешнейповерхности одного из образцов волос были обнаружены все целевыеаналиты (см. рис. 4.7.2а), что свидетельствует об эффективностиразработанной методики. На рис. 4.7.2б представлена хроматограммы и массспектры положительной пробы волос, на которой можно отметить наличиепика со временем удерживания 3.67. Данный пик соответствует химическомушуму, но не мешает идентификации целевых соединений, так как его времяудерживание не перекрывается с целевыми соединениями.Ввиду невозможности провести измерения площади поверхностиисследуемых проб волос, проведение количественной оценки содержаниявеществ на поверхности (нг/см2) невозможно. Поэтому проведениепроцедуры валидации методик анализа внешней поверхности волоснецелесообразно.98КНБАТГККНДБВГРисунок 4.7.2. Хроматограмма внешнего смыва с положительного образца волос (а), с бланковых волос (б), массспектры КНБ (в) и ТГК (г).994.8.
Анализ внутренней области волос на тетрагидроканнабинол и11-нор-∆9-тетрагидроканнабиноловую кислоту методом ВЭЖХ-МС/МССогласно литературным данным [124], в случае эпизодического ихронического употребления наркотических средств, марихуана, гашиш игашишное масло в волосах человека будут детектироваться только двасоединения:Тетрагидроканнабинол (ТГК) – основной каннабиноид, содержащийсяв конопле и оказывающий воздействия на CB1 и CB2 рецепторы ЦНС;11-нор-∆9-тетрагидроканнабиноловая кислота (ТГКК) – основнойактивный метаболит ТГК.ТГК – очень липофильное соединение, интенсивно связывается спротеинами плазмы и имеет рКа=10,6.
ТГКК также является высоколипофильным веществом кислой природы.Как известно [141], вещества проникают в структуру волоса на стадииего образования из кровотоков, омывающих волосяную луковицу, а такжемогут диффундировать в их структуру из пота, покрывающего волос вприкожной области. ТГК обладает очень низким сродством к меланину(основной компонент волоса, удерживающий экзогенные вещества), а ТГКК– еще более низким благодаря своему кислотному характеру, поэтому ониоткладываются в волосах в очень малых количествах. Авторами [141] былоустановлено, что при периодическом употреблении среднее содержание ТГКв волосах составляет 0,1-3,0 нг/мг, а ТГКК – 0,7-100,0 пг/мг.В связи с тем, что содержание целевых соединений в волосах оченьмало, для их идентификации в данном биообъекте применяютвысокочувствительные методы анализа: газовую и высокоэффективнуюжидкостнуюхроматографиюстандемныммасс-селективнымдетектированием.Использование газохроматографического методаприводит к необходимости проведения дополнительной стадиипробоподготовки – дериватизации, т.к.
ТГКК – труднолетучие соединение.Дериватизация – весьма дорогостоящий, трудоемкий и длительный этапподготовки волос к инструментальному анализу. Применение ВЭЖХМС/МС для анализа ТГК и ТГКК в волосах позволяет не только исключитьданный этап, но и заметно снижает пределы их обнаружения.Как уже было показано в п. 4.2, наиболее быстрым и эффективнымспособом подготовки волос к инструментальному анализу является щелочнаядеструкция структуры объекта с последующей жидкость-жидкостнойэкстракцией. В литературе [15, 20, 57, 58, 122, 124] представлены различныеусловия проведения деструкции и ЖЖЭ, поэтому нами проведена серия100экспериментов, направленных на выявление наиболее оптимальныхпараметров пробоподготовки волос к анализу.В качестве инструментального метода анализа применяли методВЭЖХ-МС/МС, описанный в п.
4.7. Детектирование также проводили врежиме SRM. Условия детектирования ТГКК были подобраны с помощьюраствора аналитического стандарта данного соединения (см. табл. 4.8.1)Таблица 4.8.1. Условия детектирования ТГКК в режиме SRM.Исследуемое веществоRT,Мин«Прекурсорион»11-нор-∆9тетрагидроканнабиноловая кислота4,22343,2 [M-H]-Энергиясоударения, В382828Дочерние ионы,m/z107191245Соотношенияинтенсивностей, %847100Следует отметить, что авторы [123] в качестве основного SRMперехода для ТГКК используют переход 343→299. Экспериментальноперехода, его применение для анализа волос нецелесообразно, т.к.
в матрицеволос многие эндогенные вещества дают аналогичный переход, что сильноувеличивает химический шум хроматограммы и затрудняет идентификациюТГКК в матрице волос (см. рис. 4.8.1).С целью определения условий выделения целевых соединений извнутренней области волос были использованы модельные образцы волослюдей, не употребляющих наркотических средств и психотропных веществ,отмытые от посторонних внешних примесей и потожировых выделений.101а)б)ТГККТГККРисунок 4.8.1.
Хроматограммы пробы волос, содержащей ТГКК, полученной в режиме SRMс переходом 343→299 (а) и без него (б).102К образцам модельных волос массой 100±5 мг добавляли по 100 мклраствора аналитического стандарта ТГКК производства компании «Fluka»(США) концентрацией 1 мкг/мл. Подбор условий пробоподготовкипроводили в несколько этапов:определение продолжительности и температуры щелочногогидролиза;Определение концентрации щелочи;Оценка эффективности применения гексановой очистки;Выбороптимальногосоотношениярастворителейдляэкстрагента.Для извлечения из матрицы волос стимуляторов, наркотическиханальгетиков и антидепрессантов были определены следующие оптимальныеусловия щелочного гидролиза: выдержка образца в 1,5 N растворе КОН при60˚С в течение часа. Согласно литературным данным [122], для щелочногогидролиза волос при определении в них ТГКК используют 1,0 N растворщелочи при 95˚С в течение 10-15 минут.
Применение таких условий связанос нестабильностью молекулы ТГКК в щелочной среде. В результатеэкспериментального сравнения этих двух методов деструкции волосустановлено, что степень извлечения (αтгкк) по первой схеме (41,8%) ниже,полученной по второй схеме (86,4%), в два раза, кроме того времени напроведение пробоподготовки по второму способу требуется в 4 раза меньше.Для исследования зависимости степени извлечения от концентрациииспользуемой щелочи, сравнивали эффективность гидролиза раствором КОНс концентрациями 0.5, 1.0 и 1.5 моль/л (см. табл.
4.8.2). Установлено, чтомаксимальная степень извлечения достигается при использовании 1,0 Nраствора щелочи (αтгкк=53,3%), а минимальное – при 1,5 N (αтгкк=34,0%).Следует отметить, что при использовании 0,5 N КОН (αтгкк=42,0%) в случаеобразца жестких волос деструкция происходит не полностью. Оценкаприменения гексановой чистки показала, что ввиду высокой липофильностиТГКК, такой подход резко снижает степень извлечения аналита до 9,5%.Таблица 4.8.2.концентрации щелочиЗависимостьстепенейизвлеченияКонцентрация КОН, моль/лСтепень извлечений ТГКК, %0,542,01,053,31,534,0103ТГККотДля экстракции целевого вещества из гидролизата обычно используютсмесь гексан:этилацетат. Выше показана эффективность использования такойсмеси в соотношении 2:1 для стимуляторов, наркотических анальгетиков иантидепрессантов. Для ТГКК ввиду ее более высокой липофильности былаисследована эффективность смесей гексан:этилацетат в соотношении 1:1, 2:1,3:1, 4:1 и 5:1 соответственно.
Результаты исследований зависимости степениизвлечения от соотношения растворителей в экстрагенте представлены нарис. 4.8.2Из рис. 4.8.2 следует, что при соотношении гексан:этилацетат 5:1достигается наибольшая степень извлечения ТГКК. Так как ТГК обладаетблизкой к ТГКК липофильностью, то данный экстрагент может бытьуспешно использован для извлечений обоих соединений.Рисунок 4.8.2. Зависимость степени извлечения ТГКК из гидролизатаволос от объемного соотношения гексан:этилацетат в экстрагентеСледует также отметить, что в случае применения смесей ссоотношением 1:1 и 2:1 на хроматограммах наблюдали большое количествопиков интерферирующих соединений. Оптимизированные для ТГКК и ТГКсхемы пробоподготовки волос представлены на рисунке 4.8.3.1041. К 100 мг отмытых волос добавить 3 мл 1,0 N раствора КОН ипоместить в сушильный шкаф на 15 мин при температуре 95ºС2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
