Диссертация (1091824), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Наиболее высокие степени – для схем 1 и 2. Так для AB-Fubinacaстепени извлечения составили α1= 79.0% и α2= 72.0%, для АМ-2201 α1= 94.6% иα2= 82.6% и для JWH-210 α1= 65.0% и α2= 53.8% для первой и второй схемсоответственно. Несмотря на то, что метанол (α1) продемонстрировалнезначительно большую эффективность, чем ацетонитрил (α2), дляперерастворения сухого остатка, содержащего синтетические каннабиноиды егоприменение нежелательно, так как возможно образование в инжекторехроматографаметилированныхартефактовцелевыхсоединений.Идентификация таких артефактов затруднена ввиду изменения массыродительского иона.
В связи с этим, для исследования внешней поверхностиволос была выбрана схема 2.Таким образом, разработана и апробирована на объектахкриминалистических экспертиз методика анализа внешней поверхности волосна наличие синтетических каннабиноидов трех классов методом ГХ-МС/МС.По итогам апробации методики на внешних поверхностях пяти образцов былиобнаружены пики AB-CHMINACA (см. рис.
4.9.2).Отмывку внешней поверхности волос от остатков аналитов проводилисогласно методикам, представленным в статье [131]. Для этого последовательноприменяли водный раствора ПАВ, ацетонитрил и смесь гексан:этилацетат (5:1).Контроль отмывки проводили ГХ-МС/MC анализом промывочных растворовпосле второй и третьей стадии. Исследования показали, что применениетрехстадийной отмывки необходимо ввиду высокой липофильностианализируемых соединений.114АБРисунок 4.9.2.
Хроматограмма пробы смыва с внешней поверхности волос, содержащих AB- Chminaca (а),и его масс-спектр (б).1154.10 Анализ внутренней области волос на наличие синтетическихканнабиноидов классов 3-нафтоилиндолы, индол-3-карбоксилаты ииндазол-3-карбоксамиды методом ГХ-МС/МСДля исследования внутренней области волос использовали растворыобразцов сравнения AB-PINACA, AB-Chminaca, NM-2201, JWH-210 и AM2201.
Извлечение целевых веществ из матрицы волос также изучали спомощью модельных образцов. В качестве пробоподготовки использовалиметодику, разработанную для природных каннабиноидов, а именно −щелочной гидролиз 1,5 N раствором КОН при 95ºС в течение 15 минут споследующей экстракцией смесью гексан:этилацетат в объемномсоотношении 5:1. Экстракт упаривали в токе азота при 50ºС иперерастворяли в ацетонитриле. Инструментальный анализ проводилисогласно условиям, представленным в п. 4.9.Модельные образцы волос готовили следующим образом. К заранееотмытым от посторонних примесей и потожировых выделений образцамволос массой 100±5 мг каждый добавляли по 100 мкл растворов образцовсравнения анализируемых веществ с концентрацией 1 мкг/мл.По результатам исследований рассчитаны степени извлеченияцелевых аналитов − AB-PINACA, AB-Chminaca, NM-2201, JWH-210 иAM-2201 (см.
рис. 4.10.1). Расчеты степеней проводили по формуле,представленной в п. 4.7Рисунок 4.10.1. Эффективности извлечения синтетическихканнабиноидов из внутренней области волос методом щелочного гидролиза споследующей ЖЖЭ116Как видно из рисунка 4.10.1 α для всех веществ находилась в пределах50-65%, что позволяет применять данную методику для анализа внутреннейобласти волос на наличие каннабимиметиков. Следует отметить, что общаяпродолжительность анализа внутренней области волос по данной методикесоставляет 2,5 часа. Как видно из рис. 4.10.2а матрица волос не дает MRMпереходов аналогичных переходам, характерным анализируемым веществам,что облегчает идентификацию синтетических каннабиноидов в волосах засчет низкого химического шума.Валидацию разработанной методики проводили в три этапа:1.
Определение предела детектирования (ПД) и пределаколичественной оценки (ПКО).2. Определение линейных участков калибровочных кривых.3. Определение повторяемости времени удерживания целевыханалитов.В результате проведения стандартной процедуры валидацииустановлено: ПД целевых аналитов составил 0.5 нг/мг, ПКО – 5 нг/мг,повторяемость времен удерживания − не хуже 0,03% (см. табл. 4.10.1),повторяемость находилась в диапазоне 12,8-16,5% (см. табл. 4.10.2) икоэффициенты корреляции калибровочных кривых − не ниже 0,995 (см.
рис.4.10.3).Таблица 4.10.1. Повторяемость времен удерживанияВеществоAB-PinacaAB-ChminacaАМ-2201NM-2201JWH-210114.18Время удерживания, мин23414.18 14.177 14.18514.17717.7217.7317.7217.72117.72118.82718.8318.82718.82718.82524.7324.73924.7324.73524.73524.06724.07924.06224.06224.062СреднеезначениеСКОПогрешность%14.17680.0022720.02%17.71870.0048180.03%18.82260.0049440.03%24.7320.0047330.02%24.06420.0051540.02%Таблица 4.10.2 Данные по расширенной повторяемости методикиНазваниевеществаAB-PinacaAB-ChminacaAM-2201JWH-210Сm, ед.Sc , ед.30516860908322114621521203365117,%15,012,813,216,5а)б)AB-Pinaca-FAB-ChminacaNM-2201AB-PinacaAM-2201JWH-210PB-22FРисунок 4.10.2.
Хроматограмма проб бланковых (а) и модельных (б) волос, полученных в режиме MRMсканирования118Рисунок 4.10.3. Калибровочные зависимости содержания целевых аналитов вволосахРазработанная методика удовлетворяет требованиям ГОСТ Р 8.5632009, предъявляемым к методикам измерения в Российской Федерации, итакже стала успешно применяться в экспертной практике Институтакриминалистики Центра специальной техники ФСБ России.
Данная методикабыла апробирована на объектах криминалистической экспертизы и врезультате проведенных исследований во внутренней области двух образцовволос обнаружены пики AB-CHMINACA.Глава 5. Анализ биожидкостей5.1 Разработка методики химико-токсикологического определенияамфетамина в крови методом ВЭЖХ-МС/МСВ ходе работы проведено сравнение эффективности трех наиболееизвестных методов выделения веществ из матрицы крови [55, 97].
Первыйметод представлял собой твердофазную экстракцию на сорбенте С18. Второйметод – кислотный гидролиз с последующей жидкость-жидкостнойэкстракцией смесью растворителей хлороформ : изопропанол (9:1). Третийметод сочетал жидкостную и дисперсионную твердофазную экстракции(метод Quechers). Для этого использованы модельные образцы крови,119полученные путем добавления 5 мкл стандартного метанольного раствораамфетамина с концентрацией 10 мкг/мл к 1 мл цельной бланковой крови.В результате твердофазной экстракции на сорбенте С18 степеньизвлечения амфетамина (αамф) составила 34%, кислотного гидролиза споследующей ЖЖЭ – 67 %, а методом Quechers – 72 % (см.
рис. 5.1.1).Столь низкая αамф в случае ТФЭ может быть связана либо с «проскоком»целевого вещества на этапе промывки, либо со сложностью сорбцииамфетамина на кратридже, вызванной связыванием вещества с липидамиматрицы. Применение метода Quechers по сравнению с кислотнымгидролизом не только дает более высокую степень извлечения амфетаминаиз крови, но и позволяет существенно сократить время подготовки проб кинструментальному анализу.Рисунок 5.1.1.
Диаграмма степени извлечения амфетамина из матрицыкрови по трем методикам.Инструментальный анализ проводили на высокоэффективномжидкостном хроматографе Accela фирмы Thermo Scientific (США) с тройнымквадрупольным масс-анализатором TSQ Quantum Access MAX. Разделениевеществ проводили на хроматографической колонке Hypersil Gold C-18размером 50х4,6 мм с размером частиц сорбента 1,9 мкм. В качествеэлюентов использовали 0,1 % раствор муравьиной кислоты в метаноле(элюент А) и 0,1 % раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде(элюент Б). Элюирование проводили в градиентном режиме с начальнымиконцентрациями5% элюента А и 95% элюента Б с последующимповышением концентрации элюента А до 100% к 18ой минуте и выдержкойпри данной концентрации до 23ей минуты.
Скорость потока элюента –150 мкл/мин. Температура термостата колонки − 40ºС. Масс-спектрометрработал в режиме селективного мониторинга реакций (SRM). Использовалиследующие настройки масс-анализатора: напряжение на капилляре – 4500 В,скорость и температура газа в распылителе – 10 л/мин и 350 ºС, давление враспылителе − 50 psi, скорость и температура вспомогательного газа –12 л/мин и 400 ºС.120Для определения SRM переходов анализировали пробы с помощьюраствора аналитического стандарта амфетамина концентрацией 100 нг/мл,который анализировали при различных энергиях ионизации в диапозоне 10 –40эВ с шагом 5эВ и выбирали наиболее интенсивный дочерний ион присоответствующей энергии.В таблице 5.1.1 представлены наиболее информативные ионы дляидентификации амфетамина в крови и соответствующие им энергииионизации.Таблица 5.1.1.
Условия SRM переходов для амфетамина.Родительский ионДочерний ионЭнергия ионизации,эВ136,1565,3530136,1591,2815136,15119,2910С целью проведения метрологического контроля полученной методикибыли определены следующие параметры:- максимальное отклонение времени удерживания – не более чем на0,1%;- линейный диапазон калибровочной кривой – от 10 до 250 нг/мл (см.рис. 5.1.2);- предел детектирования – 10 нг/мл (см.
рис. 5.1.2).Рисунок 5.1.2. Калибровочная кривая содержания амфетамина в крови.В результате работы создана методика (см. Приложение)количественного определения амфетамина в крови методом ВЭЖХ-МС/МС.121Рисунок 5.1.3. Хроматограмма крови, содержащей амфетамин вконцентрации 10 нг/мл.5.2 Обнаружение морфина и кодеина в моче. Поиск способовотличия употребления морфина и кодеинсодержащих препаратовДля того, чтобы проводить исследования по определению критерийдифференциации употребления морфина и кодеинсодержащих препаратов порезультатам химико-токсикологического анализа мочи, была разработанавысокочувствительная методика анализа морфина, кодеина, норкодеина вданном биообъекте с применением высокоэффективной жидкостнойхроматографии с танденмным масс-селективным детектированием.С помощью данной методики проанализировано большое количествопроб мочи после употребления кодеинсодержащих препаратов и образцовмочи наркоманов, скончавшихся вследствие передозировки морфина.Образцы трупной мочи были предоставлены ГБУЗ города Москвы «Бюросудебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения городаМосквы» в рамках договора о научно-техническом сотрудничестве.Подготовка проб к анализу.
К 3 мл пробы мочи добавляли по 1 млфосфатного буфера с рН 6,9 и 30 мкл β-глюкуронидазы E-coli K 12. Пробуперемешивали и выдерживали в термостате при температуре 58ºС в течение70 минут. Далее пробу охлаждали до комнатной температуры, добавляли1 мг хлорида натрия, 1 мл карбонатного буфера с рН 10,1 и 4 млметилтретбутилового эфира и перемешивали на ротационной мешалке втечение 10 минут. После перемешивания пробу центрифугировали при10000 об/мин в течение 10 минут и в чистую полимерную пробирку отбиралиэфирный слой (верхний). Полученный экстракт упаривали досуха при122температуре не выше 40ºС в токе азота. К сухому остатку пробы добавляли0,1 мл метанола, перемешивали и переносили во вставку вместимостью0,2 мл в виале вместимостью 2 мл.Инструментальный анализ проводили на высокоэффективномжидкостном хроматографе Acela с тройноквадрупольным масс-детекторомTSQ Quantum Access фирмы «Thermo Fisher Scientific» (США),оборудованный системой автоматического ввода пробы.
Условияинструментального метода анализа представлены в таблице 5.2.1.Таблица 5.2.1. Условия метода ВЭЖХ-МС/МС10 мм3Hypersil Gold Phenyl размером 75х4.6 мм, сдиаметром частиц сорбента 3.5 мкм.Скорость потока элюента0,8 см3/минЭлюент А0,1 % раствор муравьиной кислоты вдеионизированной водеЭлюент В0,1 % раствор муравьиной кислоты вметанолеПрограмма градиентного элюирования0 – 1 мин: 100 % элюента А;7 – 10 мин: 100 % элюента В;11 – 14 мин: 100 % элюента А.Температура термостата колонки40°СУсловия работы масс-селективного детектораСпособ ионизацииэлектрораспылениеПолярность детектируемых ионовположительнаяТемпература капилляра270°CНапряжение на капилляре4000 ВТемпература испарителя270°CРежим регистрацииМониторинг выбранных реакций (SRM)Давление газа-распылителя35 psiДавление вспомогательного газа10 psiШирина сканирования0.300 а.е.м.Время сканирования0.005 cКоличество микросканов10Объем вводимой пробыХроматографическая колонкаДля морфина и кодеина SRM переходы подбирали с использованиемметанольных растворов аналитических стандартов данных веществконцентрацией 1 мкг/мл путем прямого ввода в источник.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
