Диссертация (1091824), страница 35
Текст из файла (страница 35)
№ 078.02.001;- виалы стеклянные вместимостью 1.5 см3 с закручивающейся крышкойфирмы «Agilent Technologies» (США), кат. № 5182-0548;- вставки в виалы вместимостью 0,25 см3 с пружиной фирмы «Restek»(США), кат. № 21776;- мерная колба вместимостью 1000 см3 2-1000-2 ПМ ТС, ГОСТ 177074;- мерная колба вместимостью 100 см3 2-100-2 ПМ ТС, ГОСТ 1770-74;- цилиндр мерный на 500 мл, ГОСТ 1770-74.4.4 Реактивы и материалы- метанол для ВЭЖХ фирмы «Merck» (Германия), кат. № 1.06018.2500;- вода деионизированная с удельным электросопротивлением не менее18.2 МОм/см, ТУ 2638-263-00209792-00;229- ацетонитрил для ВЭЖХ фирмы «Sigma-Aldrich» (Германия), кат.№ 34967;- кислота муравьиная 99% «Ч», ГОСТ 5848-73;- магния сульфат безводный фирмы «Merck» (Германия),кат.
№ 1.06067.1000;- натрияацетатбезводныйфирмы«Sigma-Aldrich» (Германия),кат. № S2889;- глюкуронидазаизE.coliфирмы«Roche»(Германия)кат. № 3707601001.- эфир третбутилметиловый фирмы «Merck» кат. № 1.01845.2500.- натрия сульфат безводный фирмы «Sigma-Aldrich» кат. № 238597.- натрия гидрофосфат 12-водный фирмы «Sigma-Aldrich» кат. № 71636.-калиядигидрофосфатбезводныйфирмы«Sigma-Aldrich»кат. № 60218.- азид натрия фирмы «Sigma-Aldrich» кат. № S2002.- карбонат калия фирмы «Sigma-Aldrich» кат. №209619.- калия гидрокарбонат фирмы «Sigma-Aldrich» кат.
№ 237205.- стандартные растворы морфина и кодеина с концентрацией 1 мг/см3,произведенные в ФГУП ГосНИИОХТ.Примечания1 Средства измерений должны быть внесены в Госреестр СИ РФ и поверены вустановленные сроки, иметь клеймо и/или свидетельство о поверке.2 Реактивыиматериалыдолжныиметьпаспортаилисертификаты,подтверждающие их пригодность.3 Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств,посуды, реактивов и материалов с метрологическими и техническими характеристикамине хуже, чем у приведенных в разделе 4.5 Требования к квалификации операторовК выполнению работ допускаются лица не моложе 21 года, имеющиеквалификациюхимика-аналитикаилитехника-аналитика,прошедшиепроизводственное обучение, проверку знаний, имеющие практический опыт230работы в химических лабораторияхс реактивамии не имеющиемедицинских противопоказаний.Оператор должен знать и соблюдать настоящую методику ируководства по эксплуатации средств измерений.6 Требования безопасности и охраны окружающей среды6.1 Привыполнениианализовсоблюдаюттребованиятехникибезопасности при проведении работ с реактивами по ГОСТ 12.1.007.6.2 Требования техники безопасности при работе с электроустановкамипо ГОСТ 12.1.019.6.3 Требования организации обучения работающих безопасноститрудапо ГОСТ 12.0.004.6.4 Помещения для выполнения работ должны быть оборудованыприточно-вытяжной вентиляцией, обеспечивающей требуемую кратностьобмена воздуха на рабочих местах по ГОСТ 12.4.021.Содержание вредныхвеществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленныхГОСТ 12.1.005.6.5 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиямпожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и быть оборудованным средствамипожаротушения по ГОСТ 12.4.009.6.6 Нормирование по оценке световой среды осуществляется поотраслевомубазовомудокументуСНиП23-05-95«Естественноеиискусственное освещение».6.7 Исполнители должны быть проинструктированы по лабораторнойинструкции о мерах техники безопасности и допущены к проведению работ сповышенной опасностью.6.8 Производственные отходы собираются в специальные емкости иуничтожаются установленным порядком.7 Подготовка к проведению анализа7.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ231Дляпроведенияхроматографическогоанализаиспользуетсядвухкомпонентная подвижная жидкая фаза.Компонент А – 0,1 %-ный (объемн.) раствор муравьиной кислоты вводе.
В колбу объемом 1000 см3 помещают при помощи пипеточногодозатора1см3муравьинойкислоты.Затемдобавляют500см3деионизированной воды, содержимое колбы перемешивают и доводят объемполученного раствора деионизированной водой до метки. Раствор тщательноперемешивают и используют в качестве компонента А.Компонент Б – 0,1 %-ный (объемн.) раствор муравьиной кислоты вметаноле.
В колбу объемом 1000 см3 помещают при помощи пипеточногодозатора 1 см3 муравьиной кислоты. Затем добавляют 500 см3 метанола,содержимое колбы перемешивают и доводят объем полученного растворакарбинолом до метки. Раствор тщательно перемешивают и используют вкачестве компонента Б.7.2 Приготовление смеси растворителей для промывания иглы исистемы ввода образца после инжекцииВ мерный цилиндр на 500 см3 наливают 250 см3метанола и250 см3деионизированной воды. Смесь переносят в бутыль объемом 1 л дляпромывания иглы и системы ввода образца после инжекции. Тщательноперемешивают.7.3 Приготовление фосфатного буфераВ мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 67,5 г натриягидрофосфата, 53,75 г калия дигидрофосфата, 1 г азида натрия и добавляют400 см3 деионизированной воды. Содержимое колбы перемешивают дополногорастворенияидоводятобъемполученногодеионизированной водой до 1000 см3. Тщательно перемешивают.Величина рН буфера должна быть в пределах 6,2 – 6,5.Используется свежеприготовленным.7.4 Приготовление карбонатного буфера232раствораВ мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 75 г карбонатакалия, 75 г калия гидрокарбоната и добавляют 400 см3 деионизированнойводы.
Содержимое колбы перемешивают до полного растворения и доводятобъем полученного раствора деионизированной водой до 1000 см3.Тщательно перемешивают.Величина рН буфера должна быть в пределах 10,0 – 10,4.Срок хранения приготовленного раствора при температуре 4,0 2,0 Сне более 15 дней.7.5 Подготовка хроматографаПодготовка и проверка режимов работы хроматографа с массселективным детектором осуществляется в соответствии с инструкцией поэксплуатации.7.6 Условия ввода пробы и хроматографического разделенияОбъем вводимой пробы……………………………...…………….10 мм3.Хроматографическая колонка……………………………...……...HypersilGold Biphenyl размером 75 4.6мм, с диаметром частиц сорбента 3.5мкм.Скорость потока элюента…………………………………0,800 см3/мин.Программа градиентного элюирования:4.
0 – 1 мин: 100 % элюента А;5. 7 − 10 мин: 100 % элюента Б;6. 11 – 14 мин: 100 % элюента А.Температура термостата колонки…………………………………..400С.7.7 Условия работы масс-селективного детектораСпособ ионизации…………...………………………..электрораспыление.Полярность детектируемых ионов………...……………. положительная.Температура капилляра……………………………………………...270 C.Напряжение на капилляре…………………………………………..4000 В.Температура испарителя ……………………………………………100 C.Режим регистрации…….…… Мониторинг выбранных реакций (SRM).233Давление газа-распылителя………………………..……………….35 psiДавление вспомогательного газа …………………………………..10 psiВремя сканирования…………………………………………..……0.005 cКоличество микросканов………………………………………………..107.8 Контроль аналитической системыПеред выполнением анализа исследуемого образца необходимопроанализироватьудостоверитьсяхолостуювпробуотсутствиидеонизированнойпомех,вызванныхводы,чтобызагрязнениямианалитической системы.7.9 Подготовка пробы мочи к анализуВ коническую полимерную виалу вместимостью 15 см3 пипеточнымидозаторами вносят 3 см3 исследуемой мочи, 1 см3 фосфатного буфера и0,1 см3 β-глюкуронидазы.
Виалу закрывают завинчивающейся крышкой иперемешивают ее содержимое 2 минуты на минишейкере MS1. Затем виалупомещают в сушильный шкаф и выдерживают 70 минут при температуре57°С.Виалу с мочой, подвергнутой ферментативному гидролизу приусловиях, описанных в 7.7.1, извлекают из сушильного шкафа и охлаждаютдо комнатной температуры.
Затем в виалу вносят 1 г безводного сульфатанатрия и пипеточным дозатором 1 см3 карбонатного буфера. Далеесодержимое виалы перемешивают 2 минуты на минишейкере. После этого ввиалу пипеточным дозатором вносят 6 см3 третбутилметилового эфира,закрывают ее завинчивающейся крышкой и перемешивают ее содержимое намешалке в течении 10 минут. Затем виалу центрифугируют при 10000 об/миндо полного расслоения водного и эфирного слоев (около 5 минут). В случаеобразования геля на границе фаз виалу аккуратно встряхивают, постукиваяпо ней до разрушения геля, и повторяют центрифугирование.
Послеразделения фаз органический слой отбирают в коническую полимернуювиалу вместимостью 15 см3 и упаривают досуха на вакуумном испарителе234при 40°С (около 30 минут). К сухому остатку пипеточным дозаторомдобавляют 0,2 см3 смеси метанол : вода в соотношении 1:1, виалу закрываютзавинчивающейся крышкой и перемешивают ее содержимое на минишейкере2 минуты.
После этого содержимое виалы переносят пипеточным дозаторомво вставку в виалу вместимостью 0,25 см3 с пружиной. Вставку помещают встеклянную виалу вместимостью 1,5 см3 и закрывают завинчивающейсяпластиковой крышкой.8 Выполнение анализаПробу мочи, полученную в соответствии с п. 7.9, анализируют приусловиях, приведенных в п. 7.6 и 7.7.Ниже в таблице 1 приведены родительские и дочерние ионыанализируемых веществ, а также энергии соударения, используемые прианализе.Таблица 1.
Параметры идентификации целевых аналитовИсследуемоевеществоРодительский ион+морфин285.82 [M-H]кодеин299.79 [M-H]+норкодеин285.82 [M-H]+Дочерниеионы,m/z157.66181.67201.69211.69165.17183.70225.73243.74225.09243.10268.13Энергиясоударения дляданного иона,В39352524252824223035359 Обработка результатов анализа9.1 Идентификация соединенийДля однозначной идентификации вещества необходимо выполнениеследующих условий:235- на хроматограммах, используемых для идентификации, отношениесигнала к шуму для пика идентифицируемого вещества должно быть неменее 3:1;- время удерживания пика идентифицируемого вещества должноотличаться от соответствующего времени удерживания, указанного втаблице 1 не более, чем на 1%;- соотношения интенсивностей дочерних ионов в спектре, снятом с вершиныпика идентифицируемого вещества должны отличаться от приведенных втаблице 1 не более чем на величины, указанные в таблице 2.Таблица 2.Допустимые отклонения соотношений дочерних ионов стимуляторов, наркотиков игаллюциногеновИнтенсивность относительнобазового пика, %> 50%ВЭЖХ-МС/МС15% (абсолютная)От 25% до 50%25% (относительная)< 25%10% (абсолютная)В случае обнаружения в образце одного или нескольких исследуемыхвеществ проводится подтверждающее исследование.9.2 Процедура подтверждения наличия вещества в пробеДля подтверждения присутствия какого-либо вещества в пробепроводят исследование еѐ новой аликвоты и дополнительных проб вследующей последовательности:1.
Проба – вода.2. Проба – аликвота бланковой крови, т.е. образец, заведомо несодержащий анализируемое вещество.3. Проба – аликвота анализируемой крови.4. Проба – аликвота крови, заведомо содержащей анализируемоевещество.236Пробоподготовка образцов осуществляется в соответствии с п.7.8, апараметры оборудования устанавливаются в соответствии с п.7.5 и 7.6настоящей методики.В первой и второй пробах хроматографический пик подтверждаемоговещества должен отсутствовать.
В третьей и четвертой – присутствовать.10 Оформление результатов анализаРезультаты анализа оформляют записью в рабочем журнале поустановленной форме и удостоверяются лицом, проводившим исследования,утверждаются начальником лаборатории.237.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
