Диссертация (1091824), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Содержимое пробирки перемешивают намешалке в течение 1 минуты и переносят пипеточным дозатором в виалувместимостью 2 см3, содержащую стеклянную вставку вместимостью 0,2 см3.5.5 Подготовка ВЭЖХ-МС/МС системыВЭЖХ-МС/МС систему с установленной колонкой готовят к работе всоответствии с Руководством по эксплуатации.5.6 Условия хроматографического разделенияПараметры хроматографической системы приведены в таблице 2.Условия хроматографического разделения приведены в таблице 3.211Таблица 2.
Параметры хроматографической системыХроматографическая колонкаZorbax Eclipse Plus C182.1 мм150 мм, 1.8 мкмТемпература колонки (○С)40Скорость потока элюента, см3/мин0,3Метод ввода пробыавтоматическийОбъем вводимой пробы, мм31Таблица 3. Условия хроматографированияВремя, минСодержание элюента Б, %0,0703,01006,01006,17010,0705.7 Условия масс-спектрометрического детектированияПараметры масс-спектрометрического детектирования приведены втаблице 4. Время удерживания целевого аналита, а также его ион прекурсор,дочерние ионы и энергии соударения, используемые при анализе, приведеныв таблице 5.Таблица 4. Условия масс-селективного детектированияСпособ ионизацииПолярность детектируемых ионовТемпература капилляраНапряжение на капилляре (Spray Voltage)Режим регистрацииТемпература испарителя (Vaporizer Temp)Давление газа-распылителя (Sheath Gas Pressure)Давление вспомогательного газа (Aux Gas Pressure)Количество микроскановРазрешение на первом квадруполе (Q1)Разрешение на втором квадруполе (Q3)Время сканирования (Scan time)212электрораспылениеотрицательная350 C4000 ВМониторинг выбранныхреакций (SRM)300 C3510100,5 а.е.м.0,5 а.е.м.0,01 с (для всех дочернихионов)Таблица 5.
Параметры детектирования аналитаИсследуемое веществоRT,мин«Прекурсорион»11-нор-∆9тетрагидроканнабиноловая кислота4,22343,2 [M-H]-Энергиясоударения, В382828Дочерние ионы,m/z107191245Соотношенияинтенсивностей, %8471005.8 Проведение скриннингового анализа5.8.1 Выполнение анализаПробу, полученную согласно п. 5.4, анализируют при условиях,описанных в п. 5.6 и 5.7.В случае идентификации целевого аналита в пробе по критериям,приведенным в п.
6.1 настоящей методики, необходимо дополнительновыполнить следующие процедуры:- подтверждение наличия аналита в пробе (п. 5.8.2)- построение градуировочной кривой (п. 5.8.3)- определение количества выявленного аналита (п. 6.2).5.8.2 Процедура подтверждения наличия аналита в пробеДля подтверждения присутствия целевого аналита, выявленного впробе образца, проводят исследование его новой пробы и бланковой пробы вследующей последовательности:1. Бланковая проба мочи, т.е.
образец, заведомо не содержащийцелевого аналита.2. Проба анализируемого образца мочи.Пробоподготовка проб осуществляется в соответствии с п. 5.4,параметры оборудования устанавливаются в соответствии с п. 5.6, а анализпроводится в соответствии с п. 5.7 настоящей методики.В первой пробе хроматографический пик подтверждаемого аналитадолженотсутствовать.Во второй–долженопределяться.Аналитидентифицируется по критериям, приведенным в п.
6.1 настоящей методики.2135.8.3 Построение градуировочной кривойПриготовленные градуировочные образцы(см. п. 5.2.3) готовят канализу согласно п. 5.4 и анализируют при условиях, описанных в п. 5.5 –5.7, по три раза каждый. Полученные хроматограммы обрабатывают сиспользованием программного обеспечения «Xcalibur». Измеряют площадипиков аналита в относительных единицах. С использованием средствпрограммного обеспечения строят градуировочную зависимость площадипика аналита от его концентрации в градировочных пробах. Правильностьидентификации проверяют по критериям, приведенным в п.
6.1 настоящейметодики. Коэффициент линейной корреляции полученной градуировочнойзависимости должен быть не менее 0,99.При невыполнении указанных в п. 6.1 условий выясняют причины,приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их. Затемготовят новый набор градуровочных проб и повторяют градуировку.6 Обработка результатов6.1 Критерии идентификации аналитаЦелевой аналит считают идентифицированным в том случае, если:- абсолютное время удерживания хроматографического пика аналита впробе отличается от времени удерживания, приведенного в таблице 5, менеечем на 10 с;- соотношение сигнал/шум (S/N) для пика аналита не менее 3:1;- соотношения интенсивностей подтверждающих дочерних ионов длямасс-спектра определяемого аналита соответствуют данным таблицы 5.6.2 Количественный расчетХроматограммуобрабатываютсиспользованиемпрограммногообеспечения «Xcalibur».
В относительных единицах измеряют площадь пикааналита в пробе и на основании полученной согласно п. 5.8 градуировочнойзависимости рассчитывают содержание аналита в анализируемом образце.7 Оформление результатов анализаРезультаты анализа оформляют записью в рабочем журнале по214установленной форме и удостоверяются лицом, проводившим исследования,и утверждаются начальником лаборатории.8 Требования безопасности охраны окружающей среды8.1 Привыполнениианализовсоблюдаюттребованиятехникибезопасности при проведении работ с реактивами по ГОСТ 12.1.007.8.2 Требования техники безопасности при работе с электроустановками- по ГОСТ 12.1.019.8.3 Требованияорганизацииобученияработающихправиламбезопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.8.4 Помещения для выполнения работ должны быть оборудованыприточно-вытяжной вентиляцией, обеспечивающей требуемую кратностьобмена воздуха на рабочих местах по ГОСТ 12.4.021.
Содержание вредныхвеществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленныхГОСТ 12.1.005.8.5 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиямпожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и быть оборудованным средствамипожаротушения по ГОСТ 12.4.009.8.6 Нормирование по оценке световой среды осуществляется поотраслевомубазовомудокументуСНиП23-05-95«Естественноеиискусственное освещение».8.7 При установке, монтаже и эксплуатации ВЭЖХ-МС/МС следуетсоблюдать ПБ 03-576-03 «Правила устройства и безопасной работы сосудов,работающих под давлением».8.8 Исполнители должны быть проинструктированы по лабораторнойинструкции о мерах техники безопасности и допущены к проведению работ сповышенной опасностью.8.9 Производственные отходы собираются в специальные емкости иуничтожаются установленным порядком.2159 Требования к квалификации операторовК выполнению работ допускаются лица не моложе 21 года с высшимили средним специальным образованием, прошедшие производственноеобучение, проверку знаний, имеющие практический опыт работы вхимических лабораториях с реактивами и не имеющие медицинскихпротивопоказаний.
Оператор должен знать и соблюдать настоящую методикуи руководства по эксплуатации средств измерений.10 Требования к условиям измеренийПри подготовке к выполнению измерений и при их проведениинеобходимо соблюдатьусловияэксплуатациисредствизмеренийиоборудования, изложенные в руководствах (инструкциях) по эксплуатации.Температураокружающего воздухавпомещении,вкоторомпроводятся измерения, должна находиться в диапазоне от 15 до 25 ºС.Относительная влажность воздуха не выше 80отсутствовать пары органических растворителей.216.
В помещении должныМетодика химической идентификации амфетамина в цельнойкрови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии сприменением масс-селективного детектированияВведениеНастоящая методика идентификации разработана в соответствии стребованиями нормативных документов:- ГОСТ Р 8.563-2009 Методики (методы) измерений;- ГОСТ Р 1.5-2004 Общие требования к построению, изложению,оформлению, содержанию и обозначению;- ГОСТ Р ИСО 5725-2002 Точность (правильность и прецизионность)методов и результатов измерений1 Назначение и область примененияНастоящий документ устанавливает методику химической идентификацииамфетамина в цельной крови методом высокоэффективной жидкостнойхроматографии с применением масс-селективного детектирования.Предел обнаружения целевого вещества в цельной крови не более25 нг/см3.2 Условия выполнения анализаПри выполнении анализа соблюдают следующие условия:- температура окружающего воздуха.….………………..
от 15 до 35ºС;- атмосферное давление…………………………..…от 84,0 до 106,7 кПа;(от 630 до 800 ммрт.ст.);- относительная влажность воздуха…………………….....не более 80Эксплуатациюсредствизмеренийпроводятв;условиях,рекомендуемых технической документацией к ним.3 Метод идентификацииМетод идентификации амфетамина в цельной крови основан насравнении совокупности экспериментально полученных хроматографических217и масс-спектрометрических характеристик образца цельной крови стабличными данными.Целевое вещество извлекают из матрицы цельной крови послеосаждениябелковорганическимрастворителемметодомжидкость-жидкостной экстракции с последующей очисткой экстракта дисперсионнойтвердофазной экстракциейи измерением хроматографических и масс-спектрометрических характеристик аналитов.
Масс-спектрометрическийанализ осуществляется в режиме тандемного MC-МС сканирования повыбранным ионным реакциям (SRM).Продолжительность проведения одного анализа составляет не более3 часов без учета времени на пробоотбор.4 Средства измерений, вспомогательные устройства и техническиесредства, посуда, реактивы и материалы4.1 Средства измерений- жидкостной хроматограф с масс-селективным детектором «TSQQuantum Access» фирмы «Thermo Fisher Scientific» (США), оборудованныйсистемой автоматического ввода пробы;- дозаторы пипеточные переменного объема 10-100 мкл, фирмы Biohit,ГОСТ 28311-89;- дозаторы пипеточные переменного объема 100-1000 мкл, фирмыBiohit, ГОСТ 28311-89;- термометр ртутный лабораторный, с погрешностью измерениятемпературы 0,50°С, ТУ 25-2021.003-88;- барометр-анероид метеорологический БАММ-1, с погрешностьюизмерения давления 0,10 кРа, ТУ 25-11.1513-79;- весы аналитические AT261 Delta Range фирмы «Mettler Toledo»(Швейцария);2184.2 Вспомогательные устройства и технические средства- IBM совместимая ЭВМ с программным обеспечением для управленияи обработки данных «Xcalibur» фирмы «Thermo Fisher Scientific» (США);- шкаф сушильный по ТУ 26-05-25-70;- минишейкер MS1 фирмы «IKA» (Германия);- центрифуга 5810 R фирмы «Eppendorf» (Германия);- вакуумный испаритель Centrivap фирмы «Labconco» (США);- мешалка фирмы Reax 2 фирмы «Heidolph» (Германия);- установка для получения сверхчистой воды Millipore Direct Q3 фирмы«Millipore» (Франция);- термостат фирмы «Liebisch Labortechnik» (Германия).4.3 Посуда- конические полимерные виалы вместимостью 15 см3 фирмы Isolab(США),кат.
№ 078.02.001;- виалы стеклянные вместимостью 1.5 см3 с закручивающейся крышкойфирмы «Agilent Technologies» (США), кат. № 5182-0548;- вставки в виалы вместимостью 0,25 см3 с пружиной фирмы «Restek»(США), кат. № 21776;- мерная колба вместимостью 1000 см3 2-1000-2 ПМ ТС, ГОСТ 177074;- мерная колба вместимостью 100 см3 2-100-2 ПМ ТС, ГОСТ 1770-74;- цилиндр мерный на 500 мл, ГОСТ 1770-74.4.4 Реактивы и материалы- метанол для ВЭЖХ фирмы «Merck» (Германия), кат. № 1.06018.2500;- вода деионизированная с удельным электросопротивлением не менее18.2 МОм/см, ТУ 2638-263-00209792-00;- ацетонитрил для ВЭЖХ фирмы «Sigma-Aldrich» (Германия), кат.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
