Диссертация (1091824), страница 34
Текст из файла (страница 34)
№34967;- кислота муравьиная 99% «Ч», ГОСТ 5848-73;219- магния сульфат безводный фирмы «Merck» (Германия), кат. №1.06067.1000;- натрия ацетат безводный фирмы «Sigma-Aldrich» (Германия), кат. №S2889;- сорбент С18 фирмы «Agilent Technologies» (США), кат. № 12213012;- сорбент PSA фирмы «Agilent Technologies» (США), кат. № S2002;- стандартный раствор амфетамина с концентрацией 1 мг/см3,произведенные в ФГУП ГосНИИОХТ.Примечания1 Средства измерений должны быть внесены в Госреестр СИ РФ и поверены вустановленные сроки, иметь клеймо и/или свидетельство о поверке.2 Реактивыиматериалыдолжныиметьпаспортаилисертификаты,подтверждающие их пригодность.3 Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств,посуды, реактивов и материалов с метрологическими и техническими характеристикамине хуже, чем у приведенных в разделе 4.5 Требования к квалификации операторовК выполнению работ допускаются лица не моложе 21 года, имеющиеквалификациюхимика-аналитикаилитехника-аналитика,прошедшиепроизводственное обучение, проверку знаний, имеющие практический опытработы в химических лабораторияхс реактивамии не имеющиемедицинских противопоказаний.Оператор должен знать и соблюдать настоящую методику ируководства по эксплуатации средств измерений.6 Требования безопасности и охраны окружающей среды6.1 Привыполнениианализовсоблюдаюттребованиятехникибезопасности при проведении работ с реактивами по ГОСТ 12.1.007.6.2 Требования техники безопасности при работе с электроустановкамипо ГОСТ 12.1.019.6.3 Требования организации обучения работающих безопасноститрудапо ГОСТ 12.0.004.2206.4 Помещения для выполнения работ должны быть оборудованыприточно-вытяжной вентиляцией, обеспечивающей требуемую кратностьобмена воздуха на рабочих местах по ГОСТ 12.4.021.Содержание вредныхвеществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленныхГОСТ 12.1.005.6.5 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиямпожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и быть оборудованным средствамипожаротушения по ГОСТ 12.4.009.6.6 Нормирование по оценке световой среды осуществляется поотраслевомубазовомудокументуСНиП23-05-95«Естественноеиискусственное освещение».6.7 Исполнители должны быть проинструктированы по лабораторнойинструкции о мерах техники безопасности и допущены к проведению работ сповышенной опасностью.6.8 Производственные отходы собираются в специальные емкости иуничтожаются установленным порядком.7 Подготовка к проведению анализа7.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХДляпроведенияхроматографическогоанализаиспользуетсядвухкомпонентная подвижная жидкая фаза.Компонент А – 0,1 %-ный (объемн.) раствор муравьиной кислоты вметаноле.
В колбу объемом 1000 см3 помещают при помощи пипеточногодозатора 1 см3 муравьиной кислоты. Затем добавляют 500 см3 метанола,содержимое колбы перемешивают и доводят объем полученного растворакарбинолом до метки. Раствор тщательно перемешивают и используют вкачестве компонента А.Компонент Б – 0,1 %-ный (объемн.) раствор муравьиной кислоты вводе.221В колбу объемом 1000 см3 помещают при помощи пипеточногодозатора1см3муравьинойкислоты.Затемдобавляют500см3деионизированной воды, содержимое колбы перемешивают и доводят объемполученного раствора деионизированной водой до метки.
Раствор тщательноперемешивают и используют в качестве компонента Б.7.2 Приготовление смеси растворителей для промывания иглы исистемы ввода образца после инжекцииВ мерный цилиндр на 500 см3 наливают 250 см3метанола и 250см3деионизированной воды. Смесь переносят в бутыль объемом 1 л дляпромывания иглы и системы ввода образца после инжекции.
Тщательноперемешивают.7.3Приготовление0,4%растворамуравьинойкислотывацетонитрилеВ мерную колбу на 1000 см3 наливают 500 см3 ацетонитрила идобавляют пипеточным дозатором 2 см3 99% муравьиной кислоты. Смесьтщательно перемешивают.7.4 Приготовление стандартных растворовИсходный раствор амфетамина 1 мг/мл.
В виалу, вместимостью 1.5 млпомещают навеску амфетамина массой (0,0010 ± 0,0001) г и доводят доотметки 1 см3 метанолом. Содержимое виалы перемешивают до полногорастворения. Полученный раствор имеет концентрацию амфетамина вметаноле, равную 1,0 мг/мл (1,0 мг/см3).Срок хранения исходных растворов при температуре 4,0 2,0 Сне более 60 дней.7.5 Подготовка хроматографаПодготовка и проверка режимов работы хроматографа с массселективным детектором осуществляется в соответствии с инструкцией поэксплуатации.2227.6 Условия ввода пробы и хроматографического разделенияОбъем вводимой пробы……………………………...…………….10 мм3.Хроматографическая колонка……………………………...……...HypersilGold Biphenyl размером 50 4.6мм, с диаметром частиц сорбента 1.9мкм.Скорость потока элюента…………………………………0,500 см3/мин.Программа градиентного элюирования:1.
0 – 1 мин: 100 % раствора муравьиной кислоты в деионизированнойводе;2. 11 – 15 мин: 100 % раствора муравьиной кислоты в метаноле;3. 15–18мин:100 %растворамуравьинойкислотывдеионизированной воде.Температура термостата колонки…………………………………..400С.7.7 Условия работы масс-селективного детектораСпособ ионизации…………...………………………..электрораспыление.Полярность детектируемых ионов………...…………….
положительная.Температура капилляра……………………………………………...270 C.Напряжение на капилляре…………………………………………..4000 В.Температура испарителя ……………………………………………100 C.Режим регистрации…….…… Мониторинг выбранных реакций (SRM).Давление газа-распылителя………………………..………………….5 psiДавление вспомогательного газа …………………………………..5 psiВремя сканирования…………………………………………..……0.010 cКоличество микросканов………………………………………………..157.8 Контроль аналитической системыПеред выполнением анализа исследуемого образца необходимопроанализироватьудостоверитьсяхолостуювпробуотсутствиидеонизированнойпомех,аналитической системы.223вызванныхводы,чтобызагрязнениями7.9 Подготовка пробы цельной крови к анализуВ коническую полимерную виалу вместимостью 15 см3 пипеточнымдозатором вносят 1 см3 исследуемой крови и 2 см3 0,4% раствора муравьинойкислоты в ацетонитриле, к образовавшейся смеси присыпают 100 мг ацетатанатрия и 400 мг безводного сульфата магния.
Виалу закрывают, полученнуюсмесь перемешивают 5 минут на мешалке и центрифугируют 5 мин соскоростью 10 000 об/мин при 4º С. Затем из виалы пипеточным дозаторомотбирают 1,5 мл ацетонитрильного (верхнего) слоя в полимерную виалуобъемом 15 см3, содержащую 50 мг сорбента PSA, 50 мг сорбента С18 и 150мг безводного сульфата магния. Полученную смесь центрифугируют 5 минутпри 4 º С при 10000 об/мин, отбирают пипеточным дозатором надосадочнуюжидкость и упаривают на вакуумном испарителе при температуре 45 ºС.
Ксухому остатку пипеточным дозатором добавляют 0,2 см3 смеси метанол :вода в соотношении 1:1, виалу закрывают завинчивающейся крышкой иперемешивают ее содержимое на минишейкере 2 минуты. После этогосодержимое виалы переносят пипеточным дозатором во вставку в виалувместимостью 0,25 см3 с пружиной.
Вставку помещают в стеклянную виалувместимостью 1,5 см3 и закрывают завинчивающейся пластиковой крышкой.8 Выполнение анализаПробу цельной крови, полученную в соответствии с п. 7.8,анализируют при условиях, приведенных в п. 7.5 и 7.6.Ниже в таблице 1 приведены времена удерживания исследуемыхвеществ, их родительские и дочерние ионы, а также энергии соударения,используемые при анализе.Таблица 1.
Параметры идентификации целевого аналитаИсследуемоевеществоамфетаминRT,мин6,58Мол. Родительскиймассаион135,2136,2 [M-H]224+Дочерниеионы,m/z119,2991,2865,35Энергиясоударения дляданного иона,В1015309 Обработка результатов анализа9.1 Идентификация соединенийДля однозначной идентификации вещества необходимо выполнениеследующих условий:- на хроматограммах, используемых для идентификации, отношениесигнала к шуму для пика идентифицируемого вещества должно быть неменее 3:1;- время удерживания пика идентифицируемого вещества должноотличаться от соответствующего времени удерживания, указанного втаблице 1 не более, чем на 1%;- соотношения интенсивностей дочерних ионов в спектре, снятом с вершиныпика идентифицируемого вещества должны отличаться от приведенных втаблице 1 не более чем на величины, указанные в таблице 2.Таблица 2.Допустимые отклонения соотношений дочерних ионов стимуляторов, наркотиков игаллюциногеновИнтенсивность относительнобазового пика, %> 50%ВЭЖХ-МС/МС15% (абсолютная)От 25% до 50%25% (относительная)< 25%10% (абсолютная)В случае обнаружения в образце одного или нескольких исследуемыхвеществ проводится подтверждающее исследование.9.2 Процедура подтверждения наличия вещества в пробеДля подтверждения присутствия какого-либо вещества в пробепроводят исследование еѐ новой аликвоты и дополнительных проб вследующей последовательности:1.
Проба – вода.2252. Проба – аликвота бланковой крови, т.е. образец, заведомо несодержащий анализируемое вещество.3. Проба – аликвота анализируемой крови.4. Проба – аликвота крови, заведомо содержащей анализируемоевещество.Пробоподготовка образцов осуществляется в соответствии с п.7.8, апараметры оборудования устанавливаются в соответствии с п.7.5 и 7.6настоящей методики.В первой и второй пробах хроматографический пик подтверждаемоговещества должен отсутствовать. В третьей и четвертой – присутствовать.10 Оформление результатов анализаРезультаты анализа оформляют записью в рабочем журнале поустановленной форме и удостоверяются лицом, проводившим исследования,утверждаются начальником лаборатории.226Методика химической идентификации морфина, кодеина иихметаболита–норкодеинавмочеметодомвысокоэффективнойжидкостнойхроматографиисприменением тандемного масс-селективного детектирования.ВведениеНастоящая методика идентификации разработана в соответствии стребованиями нормативных документов:- ГОСТ Р 8.563-2009 Методики (методы) измерений;- ГОСТ Р 1.5-2004 Общие требования к построению, изложению,оформлению, содержанию и обозначению;- ГОСТ Р ИСО 5725-2002 Точность (правильность и прецизионность)методов и результатов измерений1 Назначение и область примененияНастоящийдокументустанавливаетметодикухимическойидентификации морфина, кодеина и их метаболита – норкодеина в мочеметодом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применениемтандемного масс-селективного детектирования.Предел обнаружения вышеперечисленных веществ в моче не более10 нг/ см3.2 Условия выполнения анализаПри выполнении анализа соблюдают следующие условия:- температура окружающего воздуха.….………………..
от 15 до 35ºС;- атмосферное давление…………………………..…от 84,0 до 106,7 кПа;(от 630 до 800 ммрт.ст.);- относительная влажность воздуха…………………….....не более 80227;Эксплуатациюсредствизмеренийпроводятвусловиях,рекомендуемых технической документацией к ним.3 Метод идентификацииМетод идентификации морфина, кодеина и норкодеина в моче основаннасравнениисовокупностиэкспериментальнополученныххроматографических и масс-спектрометрических характеристик образцамочи с табличными данными.Целевые вещества извлекают из матрицы мочи после ферментативногогидролиза органическим растворителем методом жидкость-жидкостнойэкстракции с последующей и измерением хроматографических и массспектрометрических характеристик аналитов. Масс-спектрометрическийанализ осуществляется в режиме тандемного MC-МС сканирования повыбранным ионным реакциям (SRM).Продолжительность проведения одного анализа составляет не более5 часов без учета времени на пробоотбор.4 Средства измерений, вспомогательные устройства и техническиесредства, посуда, реактивы и материалы4.1 Средства измерений- жидкостной хроматограф с масс-селективным детектором «TSQQuantum Access» фирмы «Thermo Fisher Scientific» (США), оборудованныйсистемой автоматического ввода пробы;- дозаторы пипеточные переменного объема 10-100 мкл, фирмы Biohit,ГОСТ 28311-89;- дозаторы пипеточные переменного объема 100-1000 мкл, фирмыBiohit, ГОСТ 28311-89;- термометр ртутный лабораторный, с погрешностью измерениятемпературы 0,50°С, ТУ 25-2021.003-88;- барометр-анероид метеорологический БАММ-1, с погрешностьюизмерения давления 0,10 кРа, ТУ 25-11.1513-79;228- весы аналитические AT261 Delta Range фирмы «Mettler Toledo»(Швейцария);4.2 Вспомогательные устройства и технические средства- IBM совместимая ЭВМ с программным обеспечением для управленияи обработки данных «Xcalibur» фирмы «Thermo Fisher Scientific» (США);- шкаф сушильный по ТУ 26-05-25-70;- минишейкер MS1 фирмы «IKA» (Германия);- центрифуга 5810 R фирмы «Eppendorf» (Германия);- вакуумный испаритель Centrivap фирмы «Labconco» (США);- мешалка фирмы Reax 2 фирмы «Heidolph» (Германия);- установка для получения сверхчистой воды Millipore Direct Q3 фирмы«Millipore» (Франция);- термостат фирмы «Liebisch Labortechnik» (Германия).4.3 Посуда- конические полимерные виалы вместимостью 15 см3 фирмы Isolab(США),кат.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
