Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (1091720), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Выяснили, что такой методне мешает реакции с ТНС, однако, у метода есть существенный недостаток – в образце (иногда)образуется мутность и тогда определение кетоамина и концентрации белка становятсяневозможным. Другим недостатком метода является трудоёмкость, что делает его применениезатруднительном при большом потоке образцов.Выделение альбумина из сыворотки крови с помощью аффинной хроматографии наголубом гелеДля выделения альбумина из сыворотки крови многие авторы используют аффиннуюхроматографию на голубом геле – краситель Cibacron® Blue F3GA, ковалентно связанный сагарозным гелем (рис. 34).
Аффи-голубой гель обеспечивает сильное связывание альбумина, длядесорбции которого требуется высокая концентрация соли (1,4 М NaCl) или хаотропногореагента (например, гуанидин хлорида). Другие белки сыворотки либо не связываются с гелем,либо элюируются раствором относительно низкой концентрацией соли.71Рисунок 34. Голубой гель, связанный с агарозой (Bio-Rad Laboratories, Instruction Manual).Альбумин выделяли согласно инструкции Bio Rad с нашими модификациями (см.
главуIII. Экспериментальная часть). При выделении контролировали полученные концентрациибелка по оптической плотности λ=280 нм. Сначала, следуя инструкции, после нанесения на гельразбавленной сыворотки и промывки соответствующим количеством 20 мМ фосфатногобуфера, альбумин элюировали тем же буфером, содержащим 1,4 М NaCl. После того, какфракции собрали, для визуализации было проведено их электрофоретическое разделение.Полученную электрофореграмму см. на рисунке 35.Рисунок 35. Электрофореграмма фракций сыворотки, полученных после элюирования с аффиголубого геля.1 – сыворотка до нанесения на гель; 2 – фракция, полученная после прохождения сыворотки черезгель; 3 – фракция, полученная после элюирования 20 мМ фосфатным буфером; 4 – фракция, полученнаяпосле элюирования 1,4 М NaCl (содержит выделенный альбумин); 5 – коммерческий ЧСА.Как видно из рисунка, треки №№ 2 и 3 содержат в основном сывороточные белки, атрек № 4 – альбумин. Однако, после того, как те же фракции были сконцентрированы спомощью ультрацентрифужных фильтров и проведен электрофорез, было замечено, чтофракция альбумина всё же содержит примеси остальных белков (рис.
36), а в первом случаеконцентрации белков было недостаточно, чтобы визуально они стали заметныэлектрофоретическом геле.на72Рисунок 36. Электрофореграмма фракций сыворотки, полученных после элюирования с аффиголубого геля и концентрирования.1 – фракция, полученная после прохождения сыворотки через гель; 2 – фракция, полученная послеэлюирования 20 мМ фосфатным буфером; 3 – фракция, полученная после элюирования 1,4 М NaCl(содержит выделенный альбумин).В дальнейшем мы подобрали условия элюирования сыворотки градиентом NaCl, вкоторых фракция альбумина смывается без примеси остальных белков: после нанесения ипрохождения через гель разбавленной в два раза сыворотки белки смывали 0,2 М NaCl в 20 мМфосфатном буфере, затем 0,4 М NaCl, затем 0,8 М NaCl.
Фракцию альбумина смывали 1,5 МNaCl.Передэлектрофоретическимразделениембелкиконцентрировали,посколькуконцентрация альбумина в элюате была недостаточной для определения кетоамина.Электрофлоеграмма белковых фракций представлена на рисунке 37.Рисунок 37. Электрофореграмма фракций сыворотки, полученных после элюирования с аффиголубого геля градиентом NaCl и концентрирования.1 – сыворотка до нанесения на голубой аффи-гель; 2 – фракция, элюированная 0,2 М NaCl; 3 –фракция, элюированная 0,4 М NaCl; 4 – фракция, элюированная 0,8 М NaCl; 5 – фракция, элюированная 1,5М NaCl (содержит выделенный альбумин).Поскольку альбумин в значительном количестве элюируется с аффи-геля уже при 0,8 МNaCl, в дальнейшем мы этот раствор не использовали, и элюировали белки при 0,2, 0,4 и 1,5 МNaCl.
Хотя из представленной на рисцнке 37 электрофореграммы видно, что на всех стадиях73элюирования происходят потери альбумина, мы сочли возможным применить этот метод вдальнейшем, поскольку рассчитывали отношение молярного количества кетоамина к молярномуколичеству альбумина.Далее определяли, возможно ли в пробе альбумина, содержащей 1,5 М NaCl, измерятькетоамин, или данная концентрация соли ингибирует реакцию с ТНС. Для этоговоспользовались калибратором кетоамина (полилизин с известным содержанием кетоамина) изкоммерческого набора (Sentinel, Италия) и приготовили серию образцов с различнойконцентрацией для построения калибровочной прямой – в 20 мМ фосфатном буфере и в том жебуфере, содержащим 1,5 М NaCl.
Кетоамин в образцах измеряли с помощью ТНС. Результатыпредставлены на графиках (рис. 38).Рисунок 38. Калибровка по кетоамину.1 – образцы приготовлены в 20 мМ фосфатном буфере, 2 – образцы приготовлены в 20 мМ фосфатномбуфере, содержащем 1,5 М NaCl.Таким образом, выяснили, что 1,5 М NaCl ингибирует ТНС и, следовательно, образцытребуют диализа. Так как после элюирования с колонки и последующего диализа концентрацияальбумина в образцах оказалось недостаточной для измерения кетоамина данным методом(около2мг/мл),всеобразцыконцентрировалиультрацентрифугированием.Послеконцентрирования получали достаточную для дальнейшей работы концентрацию альбумина –20 – 40 мг/мл.Итак, для дальнейшей работы с сывороткой крови детей с СД1 отработали методикувыделения альбумина хроматографией на голубом геле.
Модификация метода, предложенногопроизводителями аффи-геля, состояла в том, что элюцию белков проводили в градиенте NaCl, азатем альбумин концентрировали.743.2 Определение гликированного альбумина у детей с диабетом 1-го типаАнализ ЧСА, выделенного из сыворотки, с помощью анион-обменной ВЭЖХСодержаниекетоаминавальбуминеиегоокислительныйстатусмногимиисследователями рассматриваются как полезные маркеры для гликемического контроля.
Однако,существует недостаточно исследований, которые бы системно изучали этот процесс, определяявсе перечисленные показатели в альбумине: степень гликирования, окисленность коммерческихпрепаратов ЧСА и т.д. В нашей работе мы постарались наиболее полно рассмотреть не толькоизменение структуры альбумина под влиянием окисления и гликирования in vitro, но и те жефакторы в альбумине, выделенном из сыворотки крови. Для исследования были сформированыгруппы детей в возрасте 9 – 12 лет: группа I - дети с впервые выявленным СД1 (13 человек);группа II - дети, болеющие СД1 более года (11 человек); в контрольной группе (6 человек) былидети с задержкой физического развития (без метаболического синдрома и нарушенияуглеводного обмена).
Дети с диагнозами «сахарный диабет 1-го типа» и «задержка физическогоразвития» на момент забора крови находились на лечении в одном и том же отделенииМорозовской детской клинической больницы.Альбумин из сыворотки выделяли методом аффинной хроматографии с помощью аффиголубого геля. В альбумине определяли степень окисления (содержание тиоловых икарбонильных групп) и содержание кетоамина; также для каждого ребёнка проводилиразделение альбумина на анион-обменной ВЭЖХ и рассчитывали коэффициент отношенияплощадей пиков окисленной и восстановленной форм AI/AII.В качестве примера на рисунке 39 представлены хроматограммы альбумина,выделенного из сыворотки крови ребёнка с недостатком физического развития (контрольнаягруппа) (рис. 39А) и ребёнка с продолжительным сроком СД1 (рис.
39Б). Остальныехроматограммы выглядят идентично и здесь не приводятся.75Рисунок 39. Анинообменная ВЭЖХ ЧСА, выделенных из сыворотки крови детей. А – ребёнка с нарушениемфизического развития (контрольная группа); Б – ребёнка с СД1 (срок заболевания более 1 года).Из рисунка 39 видно, что хроматограмма ЧСА, выделенного из крови лабораторнымспособом и разделённого при условиях, указанных выше, имеет тот же вид, что и длякоммерческого препарата, т.е характеризуется двумя пиками (I и II), выходящими на 1-4 и 4-6,5минуте соответственно. Из представленных хроматограмм видно, что при флуоресцентнойдетекции площадь пика I, отражающего восстановленную форму альбумина, значительнопревышает таковую пика II (окисленная форма).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
