Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (1091720), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Точность измерения m/z пептидов была не хуже 1мд, при этом точность измерения масс фрагментов была не хуже 0,5 Да.По полученным спектрам была произведена идентификация в системе Mascot свышеописанным модификациями. Идентификация проводилась в режиме MS/MS Ion Search, вбазе данных NCBInr с ограничением по таксону «человек». Использовались моноизотопныеизмеренные массы, с указанием точности измерения масс родительских ионов 10 мд,фрагментов 0,6 Да, в качестве протеолитического фермента указывали трипсин, допускали до 3пропущенных участков гидролиза трипсином в пептиде.Исследование проводилось в Федеральном государственном бюджетном научномучреждении«Научно-исследовательскийинститутбиомедицинскойхимииим.В.Н.Ореховича».2. Формирование групп пациентов с диагнозом СД1Исследования проводились совместно с отделением эндокринологии №1 Российскойдетской клинической больницы (РДКБ) и с 6-м отделением Морозовской детской клиническойбольницы. При включении детей и подростков в исследование учитывали возраст, пол, срокзаболевания, антропометрические данные, содержание гликированного гемоглобина (HbAlc),44гликемический профиль в течение дня, доза инсулина (ед/кг), данные ЭМГ, наличиеосложнений и сопутствующих заболеваний, клинический и биохимический анализ крови,данные ЭКГ, УЗИ.
Было получено информированное согласие родителей детей на взятие кровидля научных исследований, проведение которых было согласовано с Этическим комитетом НИИморфологии человека РАМН. Кровь из вены забирали в утреннее время натощак в пробирки сактиватором свёртывания Sarstedt (Германия). Сыворотку отделяли центрифугированием (15мин) при 1000х g. До исследования сыворотку хранили при -70 ºС. Группы формировались посроку заболевания: в группе 1 были дети с впервые выявленным диабетом и болеющиедиабетом менее одного года; в группе 2 – болеющие более 1 года; контрольная группа состоялаиз детей с нарушением физического развития, не имеющих метаболического синдрома инарушения углеводного обмена.
Все обследуемые на момент забора крови находились в одномотделении. Биохимические характеристики указаны в таблице 4.Таблица 4. Данные пациентов, принявших участие в исследовании.Группа 1Группа 2болеют менее 1 годаболеют более 1 года99 чел:162 чел:м – 47, д – 52м – 81, д – 81Контроль117 чел:м – 66, д – 51Среднее значение ± SD Среднее значение ± SD Среднее значение ± SDВозраст, лет7,5 ± 3,511 ± 3,7стаж заболевания, лет0,3 ± 0,35,1 ± 3,1Потребность в инсулине, ед/кг0,65 ± 0,320,93 ± 0,28HbAlc, %(норма до 7%)11,2 ± 3,2pp<0.001p1=0.35p2<0.001*p<0.001*p<0.001*9,7 ± 2,78,7 ± 1,85,6 ± 0,3p1<0.001*p2<0.001*p=0,38Холестерин, мМ(норма 2.5-5.5 мМ)4,7 ± 1,24,6 ± 0,95,0 ± 0,4p1=0,32p2=0,36p=0,25ТАГ, мМ(норма 0.45-1.82 мМ)1,04 ± 0,940,92 ± 0,720,90 ± 0,23p1=0,22p2=0,27Достоверность различий по непараметрическому U-критерию Мнна-Уитни: p – между группами 1 и 2; p1 –между группами 1 и контроль; p2 – между группами 2 и контроль45Группы детей для последующих исследований (ЭМГ, определение нейрональныхантител и исследование альбумина) были разными по численности, но формировались из групп,охарактеризованных в таблице 4.3.
Определение проинсулина в сыворотке крови детей с СД1Группы обследуемых составили дети в возрасте от 3 до 14 лет с впервые выявленнымдиабетом (10 чел.), а также с продолжительностью заболевания менее 1 года (15 чел.) и более 1года (57 чел.). Для оценки референсных значений проинсулина была сформированареференсная группа взрослых добровольцев (19 мужчин, 39 женщин) в возрасте от 20 до 40 лет,проходящие ежегодное диспансерное обследование и по данным лабораторного обследования(клинический и расширенный биохимический анализ крови, клинический анализ мочи)признанные «практически здоровыми».
Содержание проинсулина и С-пептида определялиметодом ИФА с использованием стандартных наборов реактивов фирм «Biovendor» (Чехия) и«Monobind Inc.» (США) cоответственно.4. Электромиографическое исследование (ЭМГ)Группы были сформированы из детей и подростков (62 чел.) в возрасте от 3-х до 17-тилет с длительностью заболевания СД1 от 0 до 13 лет, не имеющие клинических признаков ДПН.Все пациенты с диагностированной ДПН находились на субклинической стадии, которуюсчитали выявленной при изменении двух или более параметров ЭМГ моторного и сенсорногонервов на одной стороне тела.
Пациенты были распределены на две группы по срокамзаболевания СД1: группа 1 («ранний диабет») – от впервые выявленных и до одного года (19чел., 10 девочек и 9 мальчиков) и группа II («продолжительный диабет») – болеющие болееодного года (43 чел., 19 девочек и 24 мальчика).
Кроме того, дополнительно были обследованыдва ребенка с высоким риском развития СД1 (отягощенная наследственность по СД1 инарушение толерантности к глюкозе).ЭМГ проводилось в Российской детской клинической больнице врачом МуталовойЗ.М. на 4 - канальной системе ЭМГ Nikolet VikingSelect (Nikolet biomedical, США) сиспользованием накожных электродов в фиксированное (утреннее) время суток. Больныенаходились в положении лежа. Каждому пациенту были исследованы: поверхностная ветвьмалоберцового нерва (n.peroneus superficialis) и большеберцовый нерв (n.tibialis), двигательныеикроножные (n.suralis) чувствительные нервы на обеих ногах в проксимальных и дистальныхотделах, а также двигательные и чувствительные порции срединного нерва (n.medianus) наобеих руках в проксимальных и дистальных отделах.465.
Определение аутоантител к нейрональным белкам в сыворотке детей с СД1Для исследования были сформированы группы детей и подростков (140 чел.) в возрастеот 3-х до 17-ти лет с длительностью заболевания СД1 от 0 до 13 лет, не имеющие клиническихпризнаков ДПН. Группы формировались по сроку заболевания. Группу 1 («ранний диабет») – отманифестации и до одного года составили 57 чел. Группу 2 («продолжительный диабет») сосроком заболевания более одного года составили 52 чел.
В группу 3 (контрольная) вошли 31чел. Всем детям с СД1, принявшим участие в исследовании, была проведена ЭМГ.Уровень аутоантител к F(ab)2-фрагментам антиидиотипических АТ (АТ2) кролика кнейрональным белкам ГФКБ, S100, ФРН и ОБМ определяли методом ИФА с помощьюкоммерческого набора (Биофарм-тест, Россия). Оптическую плотность измеряли на планшетномспектрофотометре Anthos2010 (Anthos, Австрия) при длине волны 450 нм. Результат оценивалив условных единицах, которые рассчитывали отношением оптической плотности образца коптической плотности контрольной сыворотки (ОПобразец/ОПконтроль).6. Экспериментальная модель диабета (СТЗ-крысы)Работу с животными проводили с соблюдением этических норм в соответствии сдействующим в Российской Федерации законодательством, нормативными документами иМеждународными стандартами по лабораторной практике (Good Laboratory Practice, GLP).
Вработе использовали 20 самцов крыс линии Wistar, весом 300-380 г. Опытной группе (10животных) вводили стрептозотоцин (СТЗ) (Sigma-Aldrich, США) в дозе 80 мг/кг веса вфизиологическом растворе однократно, внутрибрюшинно, методом орошения поджелудочнойжелезы.Контрольнойгруппе(10животных)вводиливнутрибрюшинно0,5млфизиологического раствора.
За день до введения СТЗ и физиологического раствора у крысизмеряли уровень глюкозы в крови из хвостовой вены при помощи системы контроля «OneTouch» (LifeScan, Inc, США). В дальнейшем содержание глюкозы в опытной и контрольнойгруппах измеряли на следующий день после введения СТЗ, а также на 5, 10, 17, 25 и 32 дни. Вобеих группах производили забор крови из хвостовой вены для определения уровня антител кинсулину и к нейрональным белкам.
Кровь набирали в 1,5 мл полистирольные сухие пробирки,центрифугировали при 1000g и отбирали сыворотку, которую хранили при -70°С.Определение аутоантител к инсулину и нейрональным белкам. Уровень антител кинсулину определяли методом ИФА. Реакцию проводили на поверхности полистироловогопланшета (Nunc MaxiSorp, Германия), используя в качестве антигена инсулин (ОАО«Национальные биотехнологии», Россия). Уровень антител к нейрональным белкам S100,ГФКБ, ОБМ и ФРН определяли с помощью коммерческого ИФА-набора «Нейро-АТ» (ООО47«Биофарм-тест», Россия) с применением конъюгата кроличьих антител к иммуноглобулинамIgG, IgM, IgA крысы с пероксидазой хрена (ООО «Имтек», Россия).Оптическую плотность (ОП) измеряли на планшентном спектрофотометре Anthos2010(Anthos, Австрия) при длине волны 450 нм. Изменение уровня антител для каждой крысырассчитывали в условных единицах: отношение ОП образца к ОП в пробе «0» (т.е., в пробе,взятой до введения СТЗ).
Далее рассчитывалось среднее значение в у.е. в каждой группе.7. Статистическая обработка данныхСтатистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистическихпрограмм STATISTICA 8.0 (StatSoft, USA). Для межгрупповых сравнений показателейиспользовалинепараметрическийU-критерийМанна-Уитнидлянезависимыхгрупп.Достоверность различий в группах рассчитывали с помощью углового преобразования Фишера.Достоверность различий в уровне аАТ к нейрональным белкам и инсулину внутри каждойгруппы крыс рассчитывали с помощью непараметрического критерия Уилкоксона длязависимых групп.
Различия в параметрах считали статистически значимыми при уровнезначимости p ≤ 0,05.IV. Результаты и обсуждение1. Содержание проинсулина у детей с диабетом 1- го типаКак уже неоднократно упоминалось, СД1 является гетерогенным заболеваниеммножественной этиологии. Сам по себе недостаток инсулина может быть обусловленразличными причинами. Во введении говорилось только об одной из них – аутоиммунномразрушении β-клеток. Однако нарушение в процессе синтеза и секреции везикул, содержащихинсулин, С-пептид и некоторое количество негидролизованного проинсулина, может давать тотже результат - недостаточное количество инсулина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
