Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (1091720), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Cодержание тиоловых групп и кетоамина в исследуемых препаратах альбумина.препаратоксиальбуминмеркаптоальбуминЧСА плазмыУсловия гликирования(концентрация глюкозы)0 мМ5 мМ50 мМ0 мМ5 мМ50 мМ~ 5 мМSH-группы,М/М белкаВремя инкубации (недели)Кетоамин,М/М белкаВремя инкубации (недели)1231230,280,300,310,540,780,680,230,280,340,740,890,790,120,250,280,620,690,700,260,290,490,190,260,220,200,330,810,280,320,380.160,251,050,180,310,470,73±0,050,17±0,0253Согласнополученнымданным,во-первых,исходныйкоммерческийпрепарат(оксиальбумин) изначально содержит остаток глюкозы в количестве примерно 0,2 М/М, чтохорошо согласуется с литературными данными о количестве кетоамина в альбумине [201].
Вовторых, инкубация обоих препаратов (восстановленного и окисленного) в присутствиинормального содержания глюкозы (5 мМ) не приводит к увеличению содержания кетоамина.Этот вывод кажется неожиданным лишь на первый взгляд, ведь коммерческий препарат получениз плазмы крови, где глюкоза исходно присутствовала и где протекала реакция гликирования понаиболее эффективным сайтам связывания.
Однако, в присутствии повышенного содержанияглюкозы (50 мМ) содержание кетоамина возрастает во времени, причём в составеоксиальбумина обнаруживается большее количество кетоамина на протяжении всей инкубации,чем в меркаптоальбумине: в первом случае содержание кетоамина, отнесённого к 1 М белка,возрастает с 0,49 М/М до 1,05 М/М, а во втором – с 0,22 М/М до 0,47 М/М.
Наглядно динамикасодержания кетоамина видна на рисунке 20.Рисунок 20. Содержание кетоамина при инкубации альбумина с глюкозой во времени взависимости от окисления SH-групп: 1, 2 — окиальбумин и меркаптоальбумин соответственно,инкубированные с 50 мМ глюкозой; 3, 4 — меркаптоальбумин и оксиальбумин, инкубированные с 5 мМглюкозой.Что касается тиоловых и карбонильных групп (табл.
7, 8), то их содержание в обоихпрепаратах не претерпевало заметных достоверных изменений. Содержание карбонилов всыворотке здорового донора было ниже уровня чувствительности применяемого метода.54Таблица 8. Содержание карбонильных групп в исследуемых препаратах альбумина, отнесённое к 1 М белка.препаратУсловия гликирования(концентрация глюкозы)оксиальбуминмеркаптоальбуминЧСА плазмы0 мМ5 мМ50 мМ0 мМ5 мМ50 мМ~ 5 мМкарбонильные группы,М/М белкаВремя инкубации (недели)1230,220,260,230,280,270,240,210,290,310,270,250,210,190,250,160,220,240,18< 0,05Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что окислительной «мощи»глюкозы при данных условиях недостаточно для изменения этих параметров. В работе,проведённой [201] коммерческий альбумин (содержащий 0,37 М/М SH-групп и невосстановленный) был гликирован 100 мМ глюкозой и метилглиоксалем. При этих условияхсодержание тиоловых групп незначительно снижалось по сравнению с контрольнымпрепаратом, а количество карбонильных достоверно увеличивалось только в случае сметилглиоксалем.
Следовательно, при работе на модельных препаратах крайне важноучитывать, какой исходный препарат используется и насколько условия приближены кфизиологическим.2.1.2. Определение сайтов связывания остатков лизинов и аргининов с глюкозой вальбумине методом HPLC/MS/MSПоскольку при глюкозе 50 мМ содержание кетоамина зависело от содержания SH-групп(табл. 7), а при глюкозе 5 мМ не менялось, представляется интересным определение сайтовгликирования в препаратах оксиальбумина и меркаптоальбумина, инкубированных 3 недели вприсутствии 50 мМ глюкозы.
Перед исследованием образцы альбумина подвергали гидролизутрипсином. Продукты гидролиза анализировали с помощью ВЭЖХ/МС с регистрацией m/zполученных пептидов, которые идентифицировали в системе Mascot, допуская в качествевозможных модификаций различные КПГ, перечисленные на рис. 11. Результаты представленыв табл.
9А и 9Б.55Таблица 9А. Гликированные по остаткам лизинов пептиды (K) и содержащиеся в них вероятные КПГ.Порядковыйномерлизина вмеркаптоальбуминеСиквенс пептидасайтAACLLPKLDELRDEGKASSAK175-195ADDKETCFAEEGKK561-574K564, K573AEFAEVSKLVTDLTK226-240K233AFKAWAVAR210-218K21221- 41K41ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK?ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKКПГ вмеркаптоальбуминеПорядковыйномерлизина воксиальбуминеK181, K190карбоксиметил-лизинфруктозиллизинфруктозиллизинкарбоксиметил-лизинK564, K573K23321- 51K41ATKEQLKAVMDDFAAFVEK539-557K541, K545CCKADDKETCFAEEGKK558-574K560, K564,K573CCKHPEAK437-444K539DAHKSEVAHR1-10K4DVCKNYAEAK314-323K317501-519K519EQLKAVMDDFAAFVEK542-557K545FKDLGEENFK11-20K12FKDLGEENFK11-21K12FKDLGEENFK11-21K12FKDLGEENFK11-20K12FKDLGEENFK11-20K12FPKAEFAEVSK223-233K225574-585K574KQTALVELVK525-534K525KQTALVELVK525-534K525KQTALVELVK525-534K525KQTALVELVK525-534K525414-428K414EFNAETFTFHADICTLSEKKLVAASQAALGLKVPQVSTPTLVEVSR???карбоксиэтиллизинфруктозиллизин(- 1 H2O)фруктозиллизинкарбоксиметил-лизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизинфруктозиллизин(- 1 H2O)фруктозиллизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизинфруктозиллизинфруктозиллизин(- 2 H2O)фруктозиллизин(- 1 H2O)фруктозиллизинкарбоксиметил-лизинфруктозил-K560, K564,K573K4K525K525K525K414КПГ в оксиальбуминекарбоксиметил-лизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизинфруктозиллизин(- 1 H2O)фруктозиллизинфруктозиллизин(- 1 H2O)фруктозиллизинфруктозиллизин(- 2 H2O)фруктозиллизин(- 1 H2O)фруктозиллизинфруктозил-56лизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизин(- 1 H2O)фруктозиллизинфруктозиллизинфруктозиллизинкарбоксиметил-лизинKVPQVSTPTLVEVSR?414-428K414KYLYEIAR?137-144K137KYLYEIAR?137-144K137LAKTYETTLEK349-359K351LDELRDEGKASSAK182-195K190LDELRDEGKASSAK182-196K190LDELRDEGKASSAKQR182-197K190, R195LKCASLQK198-205K199LKCASLQKFGER198-209K199, K205LSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK219-240K225, K233LVRPEVDVMCTAFHDNEETFLK?115-136K136LVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKK115-137K136LVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKK115-137K136LVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKK115-137K136LVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKK115-137K136NECFLQHKDDNPNLPR99-114K106NLGKVGSK429-436K432NLGKVGSK429-436K132NLGKVGSKCCKHPEAK429-444K432, K436,K439NLGKVGSKCCKHPEAK429-444K432, K436,K439NYAEAKDVFLGMFLYEYAR318-336QEPERNECFLQHKDDNPNLPR94-114K106QGLKCASLQKFGERAFK196-212K199, K205QIKKQTALVELVK522-534K524, K525RHPYFYAPELLFFAKR145-160K144VFDEFKPLVEEPQNLIK373-389K378VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFKQLGEYKFQNALLVR373-410YICENQDSISSKLKECCEKPLLEK263-286YTKKVPQVSTPTLVEVSR411-428K323карбоксиметил-лизинфруктозиллизин(- 1 H2O)фруктозиллизинкарбоксиметил-лизинкарбоксиэтиллизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизинкарбоксиметил-лизинK414K137K351K190K190K136лизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизинфруктозиллизинфруктозиллизинкарбоксиметил-лизинкарбоксиметил-лизинкарбоксиметил-лизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизин(- 2 H2O)карбоксиметил-лизинфруктозиллизинфруктозиллизинфруктозиллизинK144K378, K389,K396, K403K274, K276,K281K413, K414карбоксиметил-лизинкарбоксиметил-лизинфруктозиллизинфруктозиллизинкарбоксиметил-лизинпирралинфруктозиллизин57всего модифицированных глюкозойостатков лизинов2534Примечание.
Молекулярные массы КПГ: фруктозил-лизин (∆М=162 Да); фруктозил-лизин (- 1H2O) (∆М=144Да); фруктозил-лизин (- 2H2O) (∆М=126); карбоксиэтил-лизин (∆М=72 Да); карбоксиметил-лизин (∆М=58Да); пирралин (∆М=108 Да)Таблица 9Б. Гликированные по остаткам аргининов (R) пептиды и содержащиеся в них вероятные КПГ.ПорядковыйПорядковыйномерКПГ вномерКПГ в оксиСиквенс пептидасайтлизина вмеркаптолизина вальбуминемеркаптоальбуминеоксиальбуминеальбуминеAFKAWAVARLSQR210-222R218ГМИОAFKAWAVARLSQRFPK210-225R222ГМИОAWAVARLSQR213-222R218ГМИОR218ГМИОAWAVARLSQRFPK213-225R218, R222ГМИОETYGEMADCCAKQEPERNECFLQH82-114R98АФГПKDDNPNLPRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQH82-114R98ГМИОKDDNPNLPRFGERAFK206-212R209ГМИОR209ГМИОFGERAFKAWAVAR206-218R209ГМИОFQNALLVRYTK403-413R410ГМИОKVPQVSTPTLVEVSRNLGK414-432R428ГМИОLDELRDEGK182-190R186ГМИОR186ГМИОLDELRDEGKASSAK182-195R186ГМИОLDELRDEGKASSAKQR182-197R186АФГПR186АФГПLDELRDEGKASSAKQR182-197R186ГМИОR186ГМИОLSQRFPK219-225R222ГМИОR222ГМИОQEPER94- 98R98Имидазолон БQEPERNECFLQHK94-106R98ГИОR98ГИОQEPERNECFLQHKDDNPNLPR94-114R98ГИОR98ГИОRHPDYSVVLLLR?337-348R337, R348ГМИОSEVAHRFK5--12R10ГМИОTPVSDRVTK467-475R472ГМИОвсего модифицированных глюкозойостатков аргининов97Сокращения и молекулярные массы КПГ:ГМИО – Nε-(5-Гидро-5-метил-4-имидазолон-2-ил)орнитин (∆М=54 Да);АФГП – 1-Алкил-2-формил-3,4-гликозил-пиррол (∆М=270 Да);ГИО – Nε-(5-Гидро-4-имидазолон-2-ил)орнитин (∆М=40 Да).Знаком вопроса помечены те сайты, в которых содержится только конечный лизин илиаргинин аминокислота, в то время как если аминокислота модифицирована глюкозой, тогидролиз трипсином в этом месте невозможен.По результатам исследования видно, что в препарате оксиальбумина содержится 34вероятных сайтов связывания остатков глюкозы с остатками лизинов, что на 9 сайтов больше,чем в меркаптоальбумине.
Это подтверждает наше предположение, что если антиоксидантныйпул ЧСА снижен (т.е. белок содержит меньшее количество SH-групп), то и гликируется он вбольшей степени, чем белок с нормальным содержанием сульфгидрильных групп, а пригликировании формируется широкий спектр КПГ. В случае остатков аргининов существенной58разницы в количестве сайтов связывания не обнаружено.2.1.3. Флуоресценция ЧСА и содержащегося в нём пентозидинаДля того чтобы оценить, насколько изменяется структура альбумина при гликированиив нормальных и гипергликемических условиях, в препаратах окисленного и восстановленногоальбумина, инкубированных в присутствии 5 и 50 мМ глюкозы, изучали специфическуюфлуоресценцию триптофана при λвозбуждения = 285 нм и λиспускания=300-500 нм.
Во всех случаяхконцентрация белка была одинакова – 2 мг/мл, pH=7,4; все образцы перед исследованием былидиализованы. Спектры флуоресценции триптофана в белках, инкубированных с глюкозой,представлены на рисунке 21.Видно, что инкубация как окисленного, так и восстановленного белка в течение неделине влияет на интенсивность флуоресценции, как в присутствии, так и в отсутствии глюкозы(рис.
21А). Однако уже на следующей неделе происходит снижение интенсивностифлуоресценцииокисленногоальбумина(оксиальбумина),втовремякакдлямеркаптоальбумина не наблюдается каких-либо изменений. Это различие становится болеезначимым при инкубации окисленного и восстановленного белков в течение трёх недель вприсутствии 5 и 50 мМ глюкозы, когда наблюдается существенное уменьшение интенсивностифлуоресценции (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
