Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (1091720), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В последнее время в литературе появилисьработы, в которых было показано, что у больных данным заболеванием уровень проинсулина вкрови был не только не снижен, как можно было бы ожидать, учитывая, что этот гормонявляется предшественником синтеза инсулина, но и, напротив, оказался выше принятой нормы[193]. Чтобы оценить частоту встречаемости таких механизмов развития СД1, нами былоизучено содержание проинсулина в крови детей с СД1 различной продолжительности, иопределена корреляция этого показателя с содержанием С-пептида.Учитываявнутрилабораторныхуказаниефирм-производителейнормальныхграницнаизмеряемогонеобходимостьпоказателя,наустановленияпервомэтапе48исследования определяли содержание проинсулина в сыворотке крови людей, не имеющихнарушения углеводно-липидного обмена.
Референсная группа состояла из здоровых взрослыхдобровольцев (19 мужчин, 39 женщин) в возрасте от 20 до 40 лет. Средние значения уровняпроинсулина для мужчин и женщин составили 0,0045 ± 0.0019 и 0,0041 ± 0.0015 нмоль/лсоответственноиоказалисьвнутринормальногоинтервала, предлагаемогофирмой-изготовителем (0,0020 ÷ 0,0060) нмоль/л.
Поскольку статистически значимых половых различийне обнаружено, для определения внутрилабораторных нормальных границ использовалиобъединенную выборку (58 чел.), для которой среднее значение содержания проинсулина всыворотке крови составило 0,0042 ± 0,0016 нмоль/л. Таким образом, используемый вдальнейшем внутрилабораторный интервал нормальных значений содержания проинсулина(вычисляемый по формуле m ± 2σ, где m – среднее значение показателя, σ – среднееквадратическое отклонение) оказался равным 0,0010 ÷ 0,0074 нмоль/л, что согласуется слитературными данными о содержании проинсулина в крови взрослых и детей [194] исвидетельствует о корректности постановки методики.При измерении содержания проинсулина в крови больных детей не обнаружено, как иу взрослых, различий по полу (U-критерий Манна-Уитни).
Кроме того, показано, что средняявеличина данного показателя по целой выборке не выходит за пределы принятыхвнутрилабораторных границ. Аналогичный результат был получен и при распределенииконтингента по трем группам, различающимся между собой по продолжительностизаболевания: впервые выявленные, болеющие СД1 менее года и болеющие от одного года до 12лет. Также не обнаружено зависимости уровня проинсулина от «стажа» СД1 (тест КраскелаУоллиса (ANOVA) (табл. 5).Таблица 5. Содержание проинсулина (M±σ) в крови детей с СД1.ПоказательЦелая выборка(n=82)Продолжительность СД1Впервые выявленные(n=10)<1года>1 года(n=15)(n=57)Проинсулин0.0018±0.00250,0016±0,00190,0020±0,00210,0020±0,0036(нмоль/л)Примечание: M –среднее значение показателя, σ – среднее квадратическое отклонение, n – числонаблюдений.В тоже время вычисленные значения дисперсий средних величин содержанияпроинсулина в крови позволяют предположить неоднородность по данному показателю какцелой выборки, так и различающихся по продолжительности заболевания групп.Действительно, кластерный анализ, проведенный по основанию «содержание в кровипроинсулина», позволил выделить из обследованного контингента 3 группы, указанные в49таблице 6.Таблица 6.
Результаты кластерного анализа контингента детей с СД1 по основанию «содержание вкрови проинсулина».СодержаниеЦелая выборкаПродолжительность СД1проинсулина(нмоль/л)Впервые выявленные< 1года>1 годав группах(n=82)n=10n=15n=57Группа 1:0,00038±0,000250,00043±0,000300,00023±0,000160,00038±0,00028<0,0010n=44n=6n=5n=33Группа 2:0,0032±0,00190,0034±0,00200,0032±0,00200,0027±0,00170,0010-0,0078n=34n=4n=8n=22Группа 3:0.0131±0.00500.0112±0.00380,015±0,0062>0,0078n=4n=2n=2Примечание: M –среднее значение показателя, σ – среднее квадратическое отклонение, n – числонаблюдений.Как видно из представленных данных, более чем у половины лиц (54%), составившихобследуемый контингент, содержание проинсулина в крови было в 2-4 раза ниже значения,принятого за нижнюю границу нормального интервала.
Это полностью согласуется собщепринятыми представлениями о ключевой роли повреждения и гибели β-клеток островковЛангерганса в патогенезе СД1.В тоже время у значительного, сравнимого с количеством больных группы 1, числапациентов группы 2 (41 %), уровень проинсулина находился внутри нормального интервалазначений. При небольшом сроке заболевания это можно объяснить тем, что на ранних стадияхклинически выявленного СД1 сохраняется некоторая часть нативных β-клеток. Но согласноданным табл. 6, нормальный уровень проинсулина был у значительного числа больных сдлительными сроками заболевания. На основании этого можно сделать заключение о различнойстепени гибели β-клеток в поджелудочной железе больных СД1 не только на начальном этапеклинически выявленного СД1, но и при длительных сроках заболевания.
В общем, этосогласуется с данными некоторых исследователей, установивших определяемый уровень Спептида у больных с очень большими сроками заболевания (более 50 лет) [195, 196].Наконец, выявлены даже такие больные, у которых содержание прогормона всыворотке крови почти в два раза превышало верхнюю границу нормального интервалазначений.
Зависимости содержания в крови уровня проинсулина от длительности заболевания ипри таком подходе обнаружено не было.Для подтверждения полученных результатов в отдельно сформированной группе из 36пациентов (возраст 10,4±4,1 лет; продолжительность заболевания 2,9±3,3 лет) определилиуровень проинсулина и С-пептида и выявили высокий коэффициент корреляции r между этимипоказателями, равный 0,61 (p<0,05). И в этой группе было два пациента (5%), которые имели50повышенный уровень проинсулина, не коррелирующий с содержанием С-пептида (рис. 19)Рисунок 19. Корреляция между содержанием С-пептида и проинсулина в сыворотке крови 36 пациентов сразличными сроками заболевания СД1.Полученные результаты позволяют предположить, что снижение уровня инсулина приСД1 может происходить не только в результате аутоиммунной (и/или другой природы) гибели βклеток. Такая же ситуация, даже на фоне сохраненного количества секретирующих инсулинклеток, может возникнуть за счет нарушений этапа превращения проинсулина в инсулин [197].Реализация этой возможности может иметь место при мутации в гене инсулина,обуславливающей замену арг65 на гистидин, вследствие чего расщепления прогормона на Спептид и инсулин не происходит.
Возможно, именно этим обусловлена гиперпроинсулинемия,выявляемая даже у здоровых членов одной семьи [198]. Другой причиной низкого уровняинсулина может быть снижение активности гидролизующей проинсулин трипсин-подобнойпептидазы (протеинконвертазы) [199].Полученные данные о различном содержании проинсулина у пациентов с СД1 могутсвидетельствовать о существенных различиях в этиологии и патогенезе данного заболевания исогласуются с литературными данными, указывающими на его неаутоиммунную природу у 79% больных [193, 200]. В этой связи следует заметить, что измерение содержания именнопроинсулина, а не С-пептида и/или инсулина, уровень которых будет одинаково низок и врезультате гибели β-клеток, и в результате нарушений в процессе синтеза гормона, можетоказаться полезным для выявления механизмов данной патологии.Какужеупоминалось,придиабетевозникаетнеобходимостьпостоянногогликемического контроля.
Одним из маркеров гликемического контроля может служитьколичество кетоамина в альбумине – этот показатель имеет прогностическую ценность для51выявления риска развития осложнений, а также в случаях, когда определение гликированногогемоглобина затруднено, например, при анемии или гемоглобинопатии.2. Исследование гликированного альбумина in vitroМногочисленные работы, посвящённые исследованию окислительного гликированияальбумина in vitro, в основном проводились в условиях, далёких от физиологических. Какправило, исследователи использовали концентрации глюкозы, значительно превышающиедиабетические или не учитывали, что в кровотоке альбумин подвержен не только воздействиюглюкозы, но и окислению активными формами кислорода.
Однако нет единого мнения о том,какой процесс является доминирующим: окисление гликированного белка или напротив,гликирование окисленного альбумина. Исследователи из Великобритании [105] предположили,что при физиологических концентрациях глюкозы окисление может играть особую роль винициации гликирования. В работе изучалось влияние продолжительного окислительногостресса на гликирование в мягких физиологических условиях (глюкоза 5-30 мМ), используя 10нМ H2O2 в качестве окислителя. Кроме того, авторы особо подчеркнули, что для адекватногоформирования физиологических условий in vitro, коммерческий альбумин нуждается ввосстановлении SH-групп, так как при промышленном выделении альбумина они значительноокисляются.
К сожалению, авторы не определяли этот показатель, ограничившись толькооценкой содержания кетоамина.Целью нашей работы было исследовать, как изменяются различные свойствачеловеческого сывороточного альбумина (содержание кетоамина, SH-групп и карбонильныхгрупп, флуоресценция триптофана и пентозидина) под влиянием окислительного гликированияс точки зрения возможности использовать эти параметры в качестве маркеров гликоокислительного стауса альбумина, выделенного из сыворотки крови пациентов с СД1.
В задачиработы входило:- изучить влияние окислительного стресса на гликирование альбумина в условияхнормо- и гипергликемии in vitro;- исследовать альбумин, выделенный из сыворотки детей с СД1.522.1. Окислительное гликирование альбумина in vitro2.1.1. Определение содержания кетоамина, SH-групп и карбонильных групп вмолекуле альбумина, инкубированного в присутствии физиологических концентрацийглюкозыНа данном этапе определяли, как содержание SH-групп влияет на гликированиеальбумина. В работе использовали ЧСА (Sigma, Германия, A1653). Предварительно для оценкитиолового пула в этом препарате были определены SH-группы с помощью реактива Эллмана[187]. Их содержание составило 0,4 М/М, что ниже физиологической нормы, составляющей 0,70,8 М/М. Для того, чтобы получить нормальные значения, SH-группы в коммерческомальбумине были восстановлены с помощью дитиотритола (ДТТИ) до 0,67±0,1 М/М.
Дляудаления непрореагировавшего ДТТИ проводили диализ. Далее работу проводили с двумяпрепаратами – меркаптоальбумином (с восстановленными SH-группами) и оксиальбумином (т.е.коммерческий альбумин без какой либо обработки, в котором содержание SH-групп понижено).Оба препарата (40 мг/мл) были проинкубированы с различными концентрациями глюкозы (0мМ, 5мМ и 50 мМ) при 37 ºС в течение 1, 2 и 3 недель, что соответствует биологической жизниальбумина.
По окончании инкубации реакционная смесь была диализована для удалениянесвязавшейся глюкозы. С помощью калибровочных кривых в препаратах определяликонцентрации тиоловых групп и кетоамина и относили их к 1 М белка. В дальнейшем этотпоказатель обозначен как относительное содержание кетоамина (тиоловых групп) в 1 молекулебелка (М/М). Для сравнения использовали альбумин, выделенный с помощью хромотографиина голубом геле из сыворотки здорового добровольца. Результаты представлены в таблице 7(жирным шрифтом отмечены значения кетоамина, которые возрастают с увеличением времениинкубации).Таблица 7.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
