Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (1091720), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Причём, первый содержит нормальное количество кетоамина и оченьнизкое – SH-групп, а второй – нефизиологическое количество кетоамина (20 М/М) и количествоSH-групп, возможное при окислительном стрессе. Таким образом, коэффициент AI/AIIсообщает информацию об «общем» состоянии альбумина, подверженного как окислению, так игликированию. В перспективе это направление может быть предложено для клиническихисследований с целью оценки глико-окислительного состояния альбумина сыворотки крови,поэтому представляется интересным выяснить референсные значения коэффициента.2.2.
Гликирование ЧСА в нефизиологических условиях.Для того чтобы наглядно продемонстрировать, как изменяются молекулярная массаЧСА и содержание кетоамина в результате гликирования, было изучено взаимодействие белка сглюкозой при нефизиологических концентрациях (1,6 М) при 37 ºС в течение 1, 3 и 5 недель.Контрольный ЧСА инкубировался без глюкозы. После инкубации реакционную смесь65диализовали, анализировали методом электрофореза в агарозном геле и в ПААГ вденатурирующих условиях, определяли размер масс-иона (m+/z) белка методом MALDI-TOF исодержание кетоамина c помощью ТНС; флуоресценцию альбумина измеряли при λвозбуждения=285, λиспускания =290-500 нм, пентозидина при λвозбуждения=325; λиспускания =330-550 нм.На масс-спектре ЧСА, приведённом на рисунке 26 присутствует основной пикмономера альбумина с зарядом +1 (m+/z 66 405) и два дополнительных пика белка, на молекулекоторого заряд равен +2 и +3 (m+/z 33 203 и m+/z 22 077 соответственно).Рисунок 26.
Масс-спектры оксиальбумина (1) и ЧСА, инкубированного с 1,6 M глюкозой в течениеодной недели (2) , трех недель (3) и пяти недель (4).Изменениемолекулярноймассыбелкаотносительносодержаниякетоаминапродемонстрировано на рисунке 27.Рисунок 27. Изменение молекулярной массы гликированного ЧСА (1) и контрольного ЧСА (3) иизменение количества кетоамина (2) в зависимости от продолжительности инкубации с глюкозой (указанызначения масс-иона, m+/z и кетоамина, М/М).66При инкубации белка в присутствии 1,6 М глюкозы в течение трёх недель молекулярнаямасса белка увеличивается до 71 570 Да, т.е.
более, чем на 5000 Да, а содержание кетоаминавозрастает до 55 молекул на молекулу белка, т.е. в реакции гликирования задействованыпрактически все остатки лизина (рис. 27).Для образца, инкубированного с глюкозой 3 недели, был получен спектр при большомрасширении. Результат представлен на рисунке 28. Видно, что спектр представляет из себясовокупность нескольких близко расположенных масс-ионов, мало отличающихся по величине,т.е., образец содержит смесь различных продуктов реакции.Рисунок 28.
Cпектр образца ЧСА, инкубированного в присутствие 1,6 М глюкозой 3 недели.Далее образцы реакционной смеси были изучены методом электрофореза в агарозе и вПААГ. На представленных электрофореграммах (рис. 29) видно, что масса белка, которыйинкубировался при высокой концентрации глюкозы, увеличивается по сравнению с исходным иконтрольным белками.стартстартРисунок 29. Электрофореграммы различных препаратов ЧСА.А – электрофорез в агарозном геле: 1 – образец сыворотки; 2 - исходный оксиальбумин; 3 – ЧСА,инкубированный без глюкозы 3 недели; 4 - ЧСА, инкубированный с 1,6 М глюкозой 3 недели.Б – электрофорез в ПААГ: М – маркер молекулярных масс; 1 – исходный коммерческий ЧСА; 2 – ЧСА,инкубированный без глюкозы 1 неделю; 3 – ЧСА, инкубированный с 1,6 М глюкозой 1 неделю; 4 – ЧСА,инкубированный без глюкозы 3 недели; 5 – ЧСА, инкубированный с глюкозой 1,6 М 3 недели; 6 - ЧСА,инкубированный без глюкозы 5 недель; 7 - ЧСА, инкубированный с 1,6 М глюкозой 5 недель.67На представленных электрофореграммах видно, как по сравнению с исходным иконтрольным белками увеличивается масса белка, который инкубировался при высокойконцентрации глюкозы.
В случае с электрофорезом в агарозном геле можно ещё судить обизменениисвойствальбумина–всильногликированномальбуминепреобладаютотрицательные заряды, поскольку при pH > 8.0 (pH электрофоретического буфера, в которомпроисходит разделение) этот альбумин быстрее приближается к катиону.Как уже отмечалось ранее, введение большого числа гидрофильных остатков глюкозы вмолекулу белка во-первых, должно снижать положительный заряд его молекулы, и во-вторых,изменять гидрофильно-гидрофобный баланс белка, что в свою очередь должно влиять на егоструктурную организацию.
Поэтому далее исследовали спектры флуоресценции альбумина исодержащегося в нём пентозидина. Результаты представленны на рисунке 30.Рисунок 30. Спектр флуоресценции альбумина (А) и пентозидина (Б).1 – оксиальбумин (исходный коммерческий ЧСА), не инкубированный;2 - ЧСА, инкубированный 5 недель без глюкозы;3 - ЧСА, инкубированный с 1,6 М глюкозой 5 недель.Из рисунка видно, что в течение пяти недель инкубации с глюкозой внефизиологических концентрациях происходит заметное тушение флуоресценции альбумина и68возрастание флуоресценции пентозидина в гораздо большей степени, чем в присутствиифизиологических концентраций глюкозы. Следует отметить, что образование пентозидина, но вменьшей степени, происходит в белке, инкубированным 5 недель без глюкозы. Вероятно,кетоамин, присутствующий в исходном коммерческом ЧСА, при инкубации образует сшивкимежду лизином и аргинином.Итак, в результате проведенных исследований были апробированы различные методикидля оценки таких показателей альбумина как число остатков глюкозы в молекуле белка,количествокетоамина,количествоSН-групп,соотношениемеждуокисленнойивосстановленной формами белка.
Следующей задачей данного исследования была апробацияэтих методик для ЧСА, выделенного из сыворотки крови здоровых доноров.3. Определение гликированного альбумина в сыворотке крови3.1. Подбор методик для выделения альбумина из сывороткиДля решения выше поставленной задачи было необходимо отработать методикувыделения альбумина из сыворотки крови, чтобы проводить определениие кетоамина виндивидуальном белке колориметрическим методом, поскольку, как уже упоминалось, в«общий» кетоамин крови вносят вклад все сывороточные белки. Метод должен быть простым идоступным для применения в клинических лабораториях.Выделение альбумина из сыворотки крови с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ)Для измерения кетоамина в альбумине с помощью ТНС Mashiba S.
предложил убиратьинтерферирующие глобулины путём добавления к 500 мкл сыворотки 50 мг ПЭГ6000 ицентрифугированием при 2000 x g 5 минут [136]. Альбумин при этом остаётся в супернатанте, аглобулины осаждаются. При апробации данной методики мы подбирали оптимальноесоотношение сыворотки и ПЭГ: к 150 мкл сыворотки добавляли 15, 30 и 60 мг ПЭГ6000 (Sigma,США). Для эксперимента использовали сыворотку здорового донора. Эффективностьосаждения белков оценивали визуально по электрофореграмме методом электрофореза вагарозе.
На типичной электрофореграмме сывороточных белков, изображенной на рисунке 31,видно, что сывороточные белки разделяются на 6 фракций.69альбуминα1 глобулиныα2 глобулиныβ1 глобулиныβ2 глобулиныγ глобулиныРисунок 31. Электрофореграмма образца сыворотки крови в агарозном геле.Электрофореграмма c результатами опыта с ПЭГ изображена на рисунке 32.
Как видноиз рисунка, этот метод не оправдал ожиданий, поскольку часть белков всегда оставалась всупернатанте (№№ треков 2, 3), а при добавлении ПЭГа в количестве, в два раза превышающимуказанное в статье [136] (30 мг на 150 мкл сыворотки) заметно уменьшалось количествоальбумина (№№ 4, 5). При добавлении 60 мг ПЭГа на 150 мкл сыворотки альбумин практическивесь осаждался вместе с остальными белками (№№ 6,7). В среднем, общее количество белкауменьшалось на 33%.Рисунок 32.
Электрофореграмма образцов сыворотки крови в агарозном геле.1 – сыворотка без ПЭГ; 2, 3 – сыворотка с добавлением 15 мг ПЭГ; 4, 5 – сыворотка с добавлением 30 мгПЭГ; 6,7 - сыворотка с добавлением ПЭГ 60 мг.Следовательно, данный метод не годится для поставленной задачи, несмотря надешевизну, удобство исполнения и быстроту.Выделение альбумина из сыворотки крови с помощью ТХУ/спиртаДалее использовали методику выделения альбумина с помощью раствора 1,5% ТХУ в7096% этаноле по модифицированному нами методу Debro J.R.
[190]. Спирт в образце замещалиподвижной фазой А, ТХУ нейтрализовали 25% аммиаком (см. главу III. Экспериментальнаячасть). Электрофореграмма альбумина, выделенного из сыворотки здорового донора см. нарисунке 33.Рисунок 33. Электрофореграмма образцов сыворотки крови. Выделение альбумина из сывороткикрови с помощью ТХУ/спирт.1 – сыворотка; 2 – коммерческий ЧСА; 3 – альбумин, выделенный из сыворотки.Как видно из рисунка, альбумин остаётся в супернатанте, а все остальные белкиосаждаются. Чтобы определить, не интерферирует ли подвижная фаза А при определениикетоамина, был проведён сравнительный анализ – определяли кетоамин в гликированномальбумине и в том же образце, обработанном описанным методом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
