Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (1091720), страница 13
Текст из файла (страница 13)
21В).59Рисунок 21. Спектры флуоресценции исходного коммерческого ЧСА (оксиальбумина) ипрепаратов, инкубированных с глюкозой и в её отсутствие: А- 1 неделя; Б – 2 недели; В – 3 недели.0 – оксиальбумин (исходный коммерческий ЧСА), не инкубированный;1, 2, 3 – меркаптоальбумин, инкубированный глюкозой 0, 5 и 50 мМ соответственно;4, 5, 6 – оксиальбумин, инкубированный глюкозой 0, 5 и 50 мМ соответственно.При сопоставленни данных по содержанию кетоамина и интенсивности флуоресценциитого же образца можно сделать вывод, что присутствие 0,2 - 0,4 остатка кетоамина на молекулубелка не оказывает влияния на его структурную организацию. Возможно, при наличии вмолекуле белка большего количества кетоамина (выше 0,4 молекул на молекулу белка)происходит снижение интенсивности флуоресценции потому, что при данном количествеостатков глюкозы, связавшихся с остатками лизинов, существенное снижение суммарногоположительного заряда на ξ-аминогруппе приводит к уменьшению содержания альфа-спиралейв белке и к увеличению полярности окружения триптофана.Остаток глюкозы, связанный с боковой NH2-группой лизина, может реагировать сбоковыми группами аргинина, давая такой КПГ, как пентозидин.
Поскольку формирование КПГ60ведет к развитию осложнений, актуальным остается вопрос о сроках образования этихпродуктов. В исследуемых образцах определяли образование пентозидина в зависимости отвремени инкубации с глюкозой при λвозбуждения=325 и λиспускания =330-550 нм. Спектрыфлуоресценции пентозидина, образовавшегося в белках при инкубировании с глюкозой втечение 1, 2 и 3 недель, представлены на рисунке 22.
Контролем служил коммерческий препаратальбумина,которыйрастворяливфосфатно-солевомбуференепосредственнопередэкспериментом.Рисунок 22. Спектры флуоресценции пентозидина в исходном коммерческом ЧСА (оксиальбумине)и в препаратах, инкубированных с глюкозой: А- 1 неделя, Б – 2 недели, В – 3 недели.0 – оксиальбумин (исходный коммерческий ЧСА), не инкубированный;1, 2, 3 – меркаптоальбумин, инкубированный глюкозой 0, 5 и 50 мМ соответственно;4, 5, 6 – оксиальбумин, инкубированный глюкозой 0, 5 и 50 мМ соответственно.Обнаружили, что уже с первой недели инкубации белка в фосфатно-солевом буферепроисходит незначительное, но достоверное повышение интенсивности флуоресценции посравнению с исходным ЧСА (на рисунке – 0), причём как в присутствии глюкозы, так и в ееотсутствие.
Можно сделать предположение о том, что образование пентозидина идет за счёт техостатков глюкозы, которые были в исходном коммерческом препарате альбумина (0,2 Мкетоамина на 1 М белка.). По окончании третьей недели инкубации содержание пентозидиназаметно возрастает в оксиальбумине, инкубированном с 50 мМ глюкозой (на рисунке образец №6), т.е. в окисленном образце, в котором содержание сульфогрупп снижено (0,4 М/М), а61содержание кетоамина повышено (1 М/М белка).
Это вполне логичный результат, согласнокоторому при увеличении содержания кетоамина увеличивается образование пентозидина.Следует подчеркнуть, что существенное увеличение содержания пентозидина отмечаетсятолько для окисленного препарата альбумина.2.1.4. Анализ методом анионообменной ВЭЖХ различных препаратов альбуминаИтак, инкубация альбумина в фосфатно-солевом буфере сопровождается образованиемсшивок и, возможно, окислением некоторых боковых групп, причем гликированные молекулыальбумина окисляются более интенсивно, чем негликированные. Это должно приводить кобразованию разных фракций одного и того же белка, одна из которых более окислена, а другая– менее.
Далее эти фракции будут обозначены как восстановленная и окисленная фракции. Дляразделения этих фракций применили анионообменную хроматографию. Ранее Hayashi Т. былапредложена методика разделения ЧСА на фракции, содержащие SH-группы и фракции,содержащие S-S связи и производные сульфокислот (-SOnH) с помощью ионообменнойхроматографии в градиенте этанола [89]. Нами была разработана новая методика,отличающаяся типом колонки и составом подвижной фазы. Кроме того, мы изучалиособенности разделения ЧСА с различной степенью гликирования и возможность примененияэтого метода для оценки глико-окислительного статуса альбумина, выделенного из сывороткикрови пациентов с диабетом 1-го типа.Разделение восстановленной и окисленной форм ЧСА методом ВЭЖХС помощью анионообменной хроматографии анализировали следующие препаратыЧСА: меркаптоальбумин (содержит SH-групп 0,7 М/М белка и карбонильных групп 0,2М/М);оксиальбумин (содержит 0,4 М SH-групп/М белка и карбонильных групп 0,2М/М) исупероксиальбумин (содержит 0,2 М SH-групп/М белка и карбонильных групп 0,7М/М).
Первыедва уже были описаны в предыдущей главе, а третий приготовили путём окисленияоксиальбумина перманганатом калия. С анионообменной колонки белок элюировалиградиентом NaCI, детекцию осуществляли по поглощению на 280 нм и по интенсивностифлуоресценции при λвозбуждении=285 нм и λиспускания=340 нм, т.к. максимум флуоресценцииприходится на эту длину волны.На полученных хроматограммах присутствуют два основных пика (I и II) с временемудерживания 1-2 мин и 4-6 мин (рис.
23). Видно, что по мере окисления сульфгидрильных групп(т.е. уменьшения их количества) уменьшается площадь первого пика (AI) и, соответственно,возрастает площадь второго пика (AII). Полученный результат позволяет предположить, чтопервый пик относится к восстановленной форме альбумина (меркаптоальбумину), а второй- к62его окисленной форме (немеркаптоальбумину).Рисунок 23. Хроматограммы ЧСА с различной степенью окисления: А - меркаптоальбумин; Б оксиальбумин; В – супероксиальбумин.Для более полной идентификации пиков I и II относящиеся к ним фракции былисобраны отдельно и исследованы методом MALDI-TOF.
Оказалось, что в обеих фракцияхприсутствует белок с м.м. 66439, т.е. пики относятся к мономеру альбумина. К сожалению,концентрация белка в обеих фракциях была недостаточна для оценки SH-групп.Анализ ЧСА с различной степенью гликирования методом анионообменной ВЭЖХДля оценки влияния гликирования ЧСА на его тиоловый статус методом ионообменнойхроматографии исследовали два препарата белка, содержащих разное количество кетоамина.Для этого оксиальбумин (20 мг/мл) инкубировали в условиях гипергликемии и принефизиологических концентрациях глюкозы - 50 мМ и 1,6 М 3 недели при 37 ºС.
Послеинкубации реакционную смесь диализовали и определяли содержание кетоамина, количествосульфгидрильных и карбонильных групп. Установили, что препараты содержали кетоамин вколичестве 1,5 М и 20 М на моль белка соответственно; по 0,4 М SH-групп и по 0,5 Мкарбонильных групп. Из хроматограмм, представленых на рисунке 24, видно, что увеличениесодержания кетоамина в молекуле белка приводит к увеличению площади пика, которыйсоотносится с окисленной формой (пик II), в то время как содержание SH-групп остаётсянеизменным.63Рисунок 24.
Хроматограммы ЧСА с различной степенью гликирования. А- альбумин содержит 1,5М/М кетоамина и 0,4 М/М SH-групп; Б- альбумин содержит 20 М/М кетоамина и 0,4 М/М SH-групп.Как уже отмечалось выше, гликирование протекает в основном по боковым NH2группам остатков лизина и аргинина. Присоединение гидрофильного остатка глюкозы приводитк изменению гидрофобно-гидрофильного баланса белка и к уменьшению числа положительныхзарядов. Это влияет на скорость прохождения через анионобменную колонку. Следовательно,метод анионообменной хроматографии разделяет не только белок с различным содержаниемсульфогрупп, но и зарядов на молекуле, обусловленных наличием свободных боковых группаминокислот.Отношение площадей пиков I и IIИтак, полученные с помощью анионообменной хроматографии пики I и II отражаютокислительно-гликированный статус альбумина, причём пик I отвечает за «нормальную» формуальбумина, а пик II – за «изменённую».
Исходя из этого, можно предположить, что коэффициентотношения площадей пиков (AreaI/AreaII, или AI/AII) можно рассматривать как параметр,отражающий глико-окислительное состояние альбумина (рис. 25). Числовые значениякоэффициента АI/АII приведены в подписи к рисунку.64Рисунок 25.
Отношение площадей пиков AI/AII, полученных при анионообменной ВЭЖХ.Условные обозначения:ЧСА 1 – меркаптоальбумин (кетоамин 0,2 М/М; SH-группы 0,7 М/М); AI/AII=4,70.ЧСА 2 – оксиальбумин (коммерческий) (кетоамин 0,2 М/М; SH-группы 0,4 М/М); AI/AII=3,00.ЧСА 3 – супероксиальбумин (коммерческий, окисленный KMnO4) (кетоамин 0,2 М/М; SH-группы0,2 М/М); AI/AII=0,50.ЧСА 4 – гликированный альбумин (инкубированный с 50 мМ глюкозой) (кетоамин 1,5 М/М; SHгруппы 0,4 М/М); AI/AII=0,65.ЧСА 5 - гликированный альбумин (инкубированный с 1,6 М глюкозой) (кетоамин 20 М/М; SHгруппы 0,4 М/М); AI/AII=0,06.Итак, из рисунка 25 видно, что для меркаптоальбумина, содержащего нормальныеколичества кетоамина и SH-групп, коэффициент AI/AII имеет самое высокое значение – 4,70, адля супероксиальбумина и альбумина, инкубированного с глюкозой 1,6 М – самые низкие – 0,5и 0,06 соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
