Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (1091720), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Известно, что большой вклад в развитие СД1 вноситхронический воспалительный процесс, когда в крови пациентов на ранних стадиях болезниобнаруживают повышение уровня провоспалительных цитокинов (ФНО-α, ИФН-γ, ИЛ1-β, 2, 6,8, 16; CCL5, CXCL10) [49-54]. Принимая во внимание высказанные ранее предположения обучастии нейрогенных механизмов в развитии СД1 [23, 72] и полученные в данном исследованиирезультаты, свидетельствующие о высокой частоте нейрофизиологических нарушений, независящей от степени компенсации углеводного обмена и продолжительности СД1, можновысказать предположение о самостоятельном развитии ДПН, не сопряжённом с СД1.Учитывая полученные результаты о развитии ДПН на самых ранних срокахзаболевания СД1, следует своевременно назначать соответствующую терапию.5.
Определение аутоантител к нейрональным белкам у детей с диабетом 1-го типаНарушение структуры и функции периферических нервов при СД1 является актуальнойпроблемой ввиду высокой частоты встречаемости и опасности инвалидизации. Проблема такжеактуальна с точки зрения раннего выявления, профилактики и своевременного лечения. Как ужеупоминалось, диагностика субклинической (бессимптомной) стадии ДПН возможна только приэлектромиографическом обследовании, его ещё называют «золотым стандартом».
ЭМГ обычнопроводится на третий год заболевания [202], однако известно, что изменения, связанные снарушением нервных волокон, наблюдаются уже на первом году заболевания СД1 [67, 206];клиническиесимптомыприэтомотсутствуют.Крометого,электромиографическоеобследование детей и подростков может быть затруднено. В связи с этим, необходим поискновых диагностических критериев для раннего выявления этой патологии. Целью нашегоисследования был поиск ранних диагностических маркеров нарушения структуры нервныхволокон.
Так как свидетелями деградации нервных волокон может стать появление аутоантител(аАТ) к нейрональным белкам в крови, мы их рассматривали в качестве маркеров.В исследовании определяли аАТ к белкам, локализованным в различных структурахнейрональной ткани. Ниже перечислены белки, к которым определяли аАТ:88ФРН (NGF, nerve growth factor) – фактор роста нервов. Нейротрофический фактор,необходимый для развития популяций нейронов на этапе раннего онтогенеза.ГФКБ (GFAP, glial fibrillary acidic protein) – глиальный фибриллярный кислый белок.Основной структурный компонент промежуточных филаментов астроцитов.S100 – относится к семейству Са2+ связывающих белков.
Является трофическим фактором длянейронов. Синтезируется глией и имеет преимущественную локализацию в цитоплазмеастроцитов. Увеличение концентрации S-100(αβ) и S-100(ββ) в СМЖ и плазме являетсямаркером повреждения астроцитарной ткани.ОБМ (MBP, major basic protein) – основной белок миелина. Основной белок миелиновойоболочки нейрона. Миелин выполняет структурную и защитную функции и участвует впитании нервного волокна.
Маркер димиелинизирующей нейропатии.Ранее в совместном исследовании с отделением эндокринологии РДКБ былиобследованы 52 ребёнка с различными стадиями СД1 на предмет выявления ДПН. Выяснили,что ДПН встречается с одинаково высокой частотой (более 70%) как у детей с дебютом СД1, такс продолжительным стажем. В дальнейшем у этих детей методом ИФА были определены аАТ кнейрональным белкам с целью выявления зависимости между появлением этих антител иразвитием ДПН.
В исследовании принимали участие дети и подростки с СД1, отобранные вгруппы по сроку заболевания: группа 1 (57 человек) – болеют менее года, группа 2 (52 человека)– болеют год и более, группа 3 (31 человек) – контрольная группа детей.КоммерческийИФА-набор(Биофарм-тест,Россия),которыйиспользоваливисследовании, позволяет определять не сами аутоантитела (АТ1), а антитела к F(ab)2фрагментам антиидиотипических антител (АТ2), т.е. – АТ3.
На твёрдую фазу здесь сорбированыне белки, а кроличьи антитела к связывающим соответствующий антиген F(ab)2-фрагментам.Такой способ позволяет определять более широкий спектр аутоантител, в т.ч. к скрытымминорным детерминантам [207].Уровень аАТ оценивали в условных единицах, которые рассчитывали отношениемоптическойплотностиобразцакоптическойплотностиконтрольнойсыворотки(ОПобразец/ОПконтроль). Данные по нормальным значениям были предоставлены разработчикаминабора. Далее, для удобства интерпретации результатов, рассчитывали средний уровень изчетырёх аАТ для каждого ребёнка, т.к.
в случае превышения нормы повышался уровень всехчетырёх аАТ, а в случае нормального значения содержание всех четырёх аАТ было в норме.В результате обнаружили, что повышенный уровень аАТ встречается в 32% случаев удетей с диабетом до 1 года и в 38% с продолжительным сроком. В контрольной группе аАТ89были повышены у 6% детей. Достоверные отличия обнаружены только между группами 1 и 3, 2%и 3 (в обоих случаях p<0.05) (рис.
45).40353025201532%38%1056%0группа I болеют группа II болеют< 1 года, 57> 1 года 52человекчеловекаконтрольнаягруппа 31человекРисунок 45. Частота выявления повышенного уровня нейрональных антител в сыворотке крови детей сразными сроками СД1 и в контрольной группе.Достоверность различий между группами по критерию Фишера: между группами 1 и 2 p>0.05, междугруппами 1 и 3, 2 и 3 p<0,05.Далее представляло интерес выявить корреляцию между наличием ДПН и уровнемнейро аАТ. Для этого были сформированы новые группы по наличию или отсутствию ДПН:группа «ДПН» (50 чел) – дети с субклинической стадией ДПН;группа «нет ДПН» (16 чел) – дети не имеющие никаких признаков ДПН.В результате обнаружили, что у 40% детей с субклинической стадией ДПН повышенуровень нейро аАТ.
У детей с отсутствием ДПН антитела также были существенно увеличены(31%) и достоверной разницы между группами не обнаружено (р > 0.100) (рис. 46).45403530%252040 %1531%1050группа "ДПН"группа "нет ДПН"Рисунок 46. Частота выявления повышенного уровня нейрональных антител в сыворотке кровидетей с СД1 в зависимости от наличия или отсутствия ДПН. Достоверность различия между группами покритерию Фишера: p> 0.100.90Таким образом, структурные изменения периферических нервов, происходящие ужена стадии манифестации сахарного диабета, возможно, приводят к появлению АТ кнейрональным белкам, которые могут служить маркерами ранней диагностики ДПН. Однако, влитературе мало данных о связи исследуемых нами антител и ДПН.6.
Определение нейрональных аутоантител у крыс с диабетом, вызваннымстрептозотоциномРассматривая нейрональные аутоантитела как ранние диагностические маркеры длявыявления структурных нарушений периферических нервов, необходимо оценить, насколькорано они появляются во времени и насколько специфически отражают исследуемое нарушение.Для этой цели мы использовали экспериментальную модель диабета, вызываемого у крысвведением стептозотоцина (СТЗ).Диабетические СТЗ-крысы широко используются для изучения структурных ифункциональных нарушений в центральной и периферической нервной системе при СД1.Несколькими авторами на этой модели было показано, что на ранних сроках развития диабета (втечение 3-7 дней после введения СТЗ) у крыс были отмечены такие нарушения в ЦНС какснижение содержания ГФКБ в астроцитах спинного мозга, гиппокампа и мозжечка [34, 35, 208,209].
При длительном течении заболевания (2 месяца и более) наблюдались признакинейродегенеративных процессов в периферической нервной системе. Так, спустя 2 месяцапосле начала моделирования диабета было обнаружено снижение количества ФРН вседалищном нерве [33, 209] и наличие электронейрофизиологических и морфомерическихпризнаков ДПН [210, 211] у СТЗ-крыс.Целью данного этапа работы было исследовать динамику появления аутоантител кнейроспецифическим белкам S100, ГФКБ, ОБМ и ФРН в сыворотке крови крыс после введенияСТЗ. Так как нас интересовало раннее появление этих антител – возможно, одновременно сразвитием диабета, то в задачу также входило оценить уровень нейро АТ относительно скоростиразрушения β-клеток.
В качестве показателя аутоиммунного разрушения β-клеток быливыбраны аутоантитела к инсулину.В работе использовали самцов крыс линии Wistar. У животных из опытной группы (10животных) был вызван диабет введением 80 мг/кг веса СТЗ. Контрольная группа (10 животных)получала 0,5 мл физиологического раствора.
Кровь отбирали из хвостовой вены до и послеинъекций на 5, 10, 17, 25 и 32 дни. На следующий день после введения СТЗ у животныхопытной группы развилась гипергликемия (25-30 ммоль/л глюкозы), которая сохранялась напротяжении всего эксперимента (30 дней), в то время как у животных в контрольной группе91содержание глюкозы оставалось в норме на уровне 5-7 ммоль/л (рис. 47).Рисунок 47. Содержание глюкозы в сыворотке крови крыс в опытной (1) и в контрольной (2) группах.В сыворотке крови крыс обеих групп методом ИФА определяли уровень аАТ кинсулину и к четырём нейрональным белкам, который рассчитывался в условных единицах(у.е.).
Для каждого животного в различные временные точки было рассчитано отношениеоптической плотности образца к оптической плотности пробы, взятой до инъекции (начальнаяпроба «0») (ОПобразца/ОП«0»). Затем для каждой группы были рассчитаны средние значениясодержания каждого аАТ.Определение уровня аАТ к инсулину. При определении уровня аАТ к инсулинуустановили, что по сравнению с начальной пробой, в контрольной группе он не изменялся (покритерию Уилкоксона) (p>0,05), а в опытной группе достоверно увеличивался на пятый деньпосле введения СТЗ и сохранялся на таком уровне до 20-го дня эксперимента (p<0,05).Длительное повышение уровня аАТ к инсулину можно обьяснить распадом β-клеток инакоплением в кровотоке инсулина, что инициирует образование к нему антител. Присравнении опытной и контрольной групп по U-критерию Манна-Уитни оказалось, чтодостоверное повышение аАТ к инсулину наблюдалось на 5-ый и на 10-ый дни (p=0,015 иp=0,019 соответственно) (рис.
48).Рисунок 48. Аутоантитела к инсулину у крыс в опытной (1) и контрольной группе (2).92Определение уровня аАТ к нейрональным белкам. При сравнении уровня нейрональныхантител с их уровнем в начальной пробе по критерию Уилкоксона установили, что в опытнойгруппе содержание аАТ ко всем четырём нейрональным белкам достоверно возрастало на 5, 10,17, 25 и 32 дни (для каждого значения p<0,05), а в контрольной группе оставалось безизменений (для каждого значения p>0,05).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
